1

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp trớc hết tôi xin đợc gửi lời cảm ơn
chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Thị Thuý. Cô đ tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận
tình hớng dẫn tôi trong toàn bộ khoá luận. Tôi xin đợc gửi lời cảm ơn tới chị Phan Thị Thanh Thúy. Chị đ chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực tập khoá luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cô chú, các anh chị làm việc tại
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di Truyền Nông
Nghiệp đ giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập.

Tôi xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy, cô
giảng dạy tại khoa CNSH - Viện Đại Học Mở Hà Nội đ hớng dẫn, giảng dạy tôi
trong quá trình học tập tại trờng.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đ động viên tạo điều kiện giúp tôi
hoàn thành khoá luận này.

Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2010
Sinh viên: Phạm Thị Nguyệt

Phần 2: vật liệu và phơng pháp nghiên cứu.28

2.1. Vật liệu nghiên cứu.28
2.2. Phơng pháp nghiên cứu.28
2.2.1: Chọn mẫu và xử lí mẫu.28
2.2.2. Các bớc thực hiện 29
a. Nghiên cứu khả năng tạo chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 29
3

b. Nghiên cứu ảnh hởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,1mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía
ROC26 và BH1 30
c. Nghiên cứu ảnh hởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và
BH1 30
d. Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa tới quá trình nhân chồi của hai giống
mía ROC26 và BH1 31
e. Nghiên cứu ảnh hởng của trạng thái môi trờng tới quá trình nhân chồi
cảu hai giống mía ROC26 và BH1 31
f. Nghiên cứu ảnh hởng của dung tích môi trờng tới quá trình nhân chồi
của hai giống mía ROC26 và BH1 32
g. Nghiên cứu ảnh hởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình
kéo dài chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 32
h. Nghiên cứu ảnh hởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình
hình thành rễ của hai giống mía ROC26 và BH1 33
i. Nghiên cứu ảnh hởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây trên vờn ơm.33
2.2.6. Thu thập và xử lí số liệu33
Phần 3: kết quả và thảo luận 35
3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng từ cây mía 35
3.2. Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ hai giống mía ROC26 và BH1 35


BAP 6-Benzyl Amino Purin
IAA Indol-3-Axetic Acid
IBA 3-Indol Butyric Acid
NAA
α-Naphthyl Acetic Acid
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid
MS Mura Shige vµ Skoog
NSTB N¨ng xuÊt trung b×nh
CTMT C«ng thøc m«i tr−êng
nội giống và trao đổi nguồn gen. Để tạo đợc các giống mía cho năng suất, tỷ lệ
đờng cao và cây sạch bệnh thì công nghệ nuôi cấy mô là một đòi hỏi hết sức cấp
bách.
7

Chất kích thích sinh trởng là một yếu tố quyết định sự thành công của công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy để có đợc những giống mía chất lợng
cao ta phải tìm hiểu ảnh hởng của các chất kích thích sinh trởng lên các giống
mía. Chỉ có nh vậy ta mới có thể tạo đợc điều kiện môi trờng tối u cho cây
phát triển nhằm đạt đợc năng xuất cao nhất. Hiện nay hai giống mía chính đợc
đa vào trồng để sản xuất đờng chủ yếu là giống mía ROC26 và giống BH1.Vì
đây là hai giống mía có hàm lợng đờng cao hơn hẳn so với các giống mía nhập
ngoại khác của nớc ta. Để phục vụ cho việc đa hai giống mía ROC26 và BH1 ra
trồng hàng loạt với diện tích lớn mang lại năng xuất cao, chúng tôi đ tiến hành
nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu ảnh hởng của một số chất điều hòa sinh
trởng đến quá trình nhân nhanh của hai giống mía ROC26 và BH1 bằng
phơng pháp nhân nhanh IN VITRO
II. mục đích và yêu cầu của đề tài:
1.1. mục đích:
- Xác định đợc các chất điều hòa sinh trởng thích hợp và nồng độ cần bổ
sung vào môi trờng nuôi cấy hai giống mía ROC26 và BH1 bằng in vitro để đạt
hiệu quả nhân nhanh cao nhất.
1.2. yêu cầu:
- Xác định đợc nồng độ của BAP, NAA, 2,4-D cần bổ sung vào môi trờng
nuôi cấy.
- Xác định đợc nồng độ % của nớc dừa, hàm lợng agar (g/l) cần bổ sung
vào môi trờng nuôi cấy.
- Tìm đợc giá thể thích hợp để đa cây in vitro ra vờn ơm trớc khi đa
cây ra ngoài đồng ruộng.


trồng mía trên nhiều loại đất khác nhau, từ 70% sét đến 70% cát. Đất thích hợp
nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tôt và
dễ thoát nớc. Tuy nhiên ph của đất phải giới hạn từ 4-9, ph thích hợp nhất cho
cây mía phát triển từ 5,5 đến 7,5.
1.1.3. Phân loại giống mía ở Việt Nam:
Trên thực tế hiện nay ở Việt Nam, cây mía đợc chia thành hai loại chính:
Mía ăn và mía ép công nghiệp.
- Mía ăn: Nhóm này chiếm diện tích rất ít, chỉ một phần nhỏ và tập trung chủ
yếu ở các tỉnh nh: Hà Tây, Hng Yên, Hòa Bình Đây là nhóm mía nhiệt đới,
9

thân mềm, nhỏ, hàm lợng đờng glucose và fructoza cao hơn các nhóm khác nên
mát và bổ. Nhóm mía này hoàn toàn là nhóm mía nguyên thủy cha trải qua công
nghệ chuyển gen hiện đại. Nhóm mía này có thể trồng quanh năm không theo mùa
vụ chính, không chịu ảnh hởng của các yếu tố ngoại cảnh, tuy nhiên thì yêu cầu
về chế độ phân bón cao không thích hợp để trồng cây công nghiệp. Một số giống
tiêu biểu nh mía tím, mía chân gà
- Mía ép công nghiệp: Đây là các giống mía dùng để phục vụ cho công
nghiệp chế biến đờng, phần lớn các giống mía này đợc nhập từ Đài Loan, ấn Độ,
Trung Quốc. Căn cứ vào thời điểm chín công nghiệp của mía ngời ta chia mía ép
công nghiệp thành các nhóm chính nh sau:
+ Nhóm mía chín sớm: Nhóm này chiếm khoảng 20-30% diện tích của vụ,
thu hoạch vào đầu tháng 10. Nhóm này gồm:
Giống Việt đờng 54-143 đây là giống mía đợc nhập của Trung Quốc và
đợc trồng ở Việt Nam từ rất lâu, thân cây thẳng để nhánh ít, mầu đỏ, chín sớm,
chiếm 50-60% của nhóm.
Giống Neo 320 là giống của ấn Độ đợc trồng nhiều ở miền Nam, diện tích
chiếm 10% của cả nhóm.
Giống Ja 60-5 chiếm khoảng 40% của cả nhóm, có khả năng cho năng xuất
từ 80-100 tấn/ha, giống này nảy mầm chậm nhng để tập chung, chín sớm, thân to

- Các nguyên tố đa lợng và vi lợng:
Nguyên tố đa lợng: Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm. Những nguyên tố N,
S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tợng.
Nitơ: Dùng ở dạng muối NO
3
-
và NH
4
+
riêng rễ hoặc phối hợp với nhau.
Photpho: Là nguyên tố mà mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu cao và
thờng đợc đa vào môi trờng ở dạng đờng Photpho.
Lu huỳnh: Đợc sử dụng ở dạng muối SO
4
2-
nồng độ thấp còn dạng SO
3
2-

và SO
2
2-
kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trờng nuôi cấy.
Na
+
và Cl
-
: Cần ở nồng độ thấp và đợc đa vào môi trờng cùng với muối
khoáng khi điều chỉnh ph môi trờng.
Các nguyên tố vi lợng:

Nớc dừa: Trong nớc dừa có nhiều axit amin tự do, axit amin liên kết, axit
hữu cơ, đờng, ARN Nớc dừa là chất bổ sung đặc biệt cho nuôi cấy mía.
Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): Chứa một số đờng, vitamin, một số
chất có hoạt tính điều hòa sinh trởng.
Dịch chiết nấm mem: Thành phần chủ yếu chứa đờng, axit nucleic, axit
amin, vitamin, auxin, muối khoáng
Dịch thủy phân Casein: Làm nguồn bổ sung axit amin.
19

Agar: Đây là thành phần polisaccharit của tảo có tác dụng làm đông môi
trờng ở nhiệt độ < 40
0
C. Thờng bổ sung vào môi trờng nuôi cấy từ 5g/l
đến 6g/l.
Các chất điều hòa sinh trởng:
Các chất kích thích sinh trởng có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất ở một mức độ hợp
lý thì chúng ta có thể điều khiển đợc chiều hớng phát sinh hình thái của
mẫu nuôi cấy. Auxin và Cytokinin là hai chất kích thích sinh trởng đợc sử
dụng phổ biến nhất hiện nay.
Auxin cần bổ sung vào giai đoạn tạo callus, kéo dài chồi và nhân nhanh
in vitro.
Cytokinin bổ sung vào môi trờng nuôi cấy ở giai đoạn ra rễ, nhân chồi.
Tỷ lệ kết hợp giữa Auxin và Cytokinin phù hợp sẽ định hớng cho cây
tạo rễ hay tạo chồi:
Auxin
+ > 1. Mẫu nuôi cấy định hớng u tiên phát triển rễ.
Cytokinin

Auxin

của cây mà không phải là hợp tử nh chồi hình thành từ callus.
Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây nh: đoạn thân, mô lá Trong
quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để bắt tế bào
sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô
sẹo.
c. Phơng pháp tạo phôi vô tính:
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào soma
gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có
thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tơng tự nh tạo chồi
bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh
tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua
giai đoạn phát triển mô seo. Sự hình thành phôi trải qua hai bớc chính:
Bớc 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình
này cần môi trờng giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào
phôi, đồng thời Auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số lợng tế bào
thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là
21

các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm
đặc, giàu protein, ARN thông tin.
Bớc 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trờng nuôi cấy của giai
đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, nếu nồng độ của Auxin cao kích thích
sự tạo thành phôi nhng lại ức chế cho quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo
của phôi này. Nh vậy nồng độ chất điều tiết sinh trởng hợp lí rất quan trọng để
có các phản hồi thích hợp. Nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nồng độ cao
có thể gây ức chế hoặc gây độc.
d. Các bớc chính trong nhân giống in vitro:
Theo George (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm năm
bớc sau:
Bớc 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trớc khi tiến hành nhân giống in

Quy trình nhân nhanh của các giống mía đợc thể hiện trong sơ đồ dới đây: Chọn mẫu và xử
lý mẫu
Chọn cây u việt
từ giống u việt
Chọn mẫu và xử
lý mẫu
Nuôi cấy chồi
đỉnh (chồi nách)
Tạo callus từ lát
cắt lá non
Tạo cụm chồi
Kéo dài chồi

Tái sinh chồi

Đa cây ra ngoài
đồng ruộng
Đa cây ra vờn ơm

Ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh
231.2.6. ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm hàng loạt các kĩ thuật khác nhau đ đem lại
khả năng ứng dụng hết sức rộng ri trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:


Tế bào
- Tạo đột biến ở mức độ tế bào.
- Tạo tế bào trần để lai vô tính.
- Biến nạp gen.
- Nuôi cấy tế bào đơn.
Đỉnh chồi
(Đỉnh sinh
trởng)
- Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền.
- Làm sạch virut.
- Nghiên cứu sinh lý phát triển.
- Là đờng hớng tái sinh chủ ứng dụng:
24

Phân hóa phôi
vô tính
+ Nhân nhanh .
+ Sản xuất hạt nhân tạo.
- Cung cấp vật liệu để tạo các Protoplat có khả năng sinh phôi.
- Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor. Đột biến soma
- Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tởng song cũng
thiếu một số tính trạng mong muốn.
- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và

cấy mô gọi là Kinetin. Năm 1963 Letham và Miller lần đầu tiên tách đợc
Cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là Zeatin và có hoạt tính tơng tự.
Sau đó ngời ta phát hiện Cytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và
là một nhóm Phytohormone quan trọng ở trong cây.
Trong nuôi đề tài này chúng tôi sử dụng hai nhóm chất điều hòa sinh trởng
chính là Auxin và Cytokinin.
1.3.2. Nhóm Auxin:
- Auxin là nhóm chất điều tiết sinh trởng thực vật đợc sử dụng thờng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp với các thành phần khác
của môi trờng dinh dỡng để kích thích sự tăng trởng của mô sẹo, huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó đợc kết hợp với
Cytokinin.
- Axin có tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của
tầng phát sinh, quả Tác dụng sinh lý của Auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế
bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hm sự sinh trởng của chồi bên, kìm hm sự
rụng hoa, rụng quả. Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (Protein, Cellulose,
Pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng. Auxin đợc xem là hormone thực vật quan
trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trởng và
biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thờng của thực vật. Auxin cùng với
một số chất điều hòa khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia
thành cơ quan thực vật hoàn chỉnh.
- Có bốn yếu tố ảnh hởng tới sự lựa chọn loại Auxin:
+ Kiểu tăng trởng hoặc phát triển cần nghiên cứu của mẫu cấy.
+ Hàm lợng Auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy .
+ Khả năng tổng hợp Auxin nội sinh của mẫu cấy.
+ Sự tác dụng qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh.
- Vai trò chính của Auxin: