31
đầu tiên của hoa đƣợc áp dụng thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhân
giống vô tính bằng giả hành, …
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro của lan
Cymbidium nhờ vào nuôi cấy các bộ phận nhƣ sau:
- Thân lan (Vij, S.P., K. Kondo và ctv 1994).
- Hạt lan (Nayak, N.R., Chand, P.K. và ctv 1998).
- Callus (Chang C và Chang WC 1998).
Theo Chang C và Chang WC (1998) đã nhân giống in vitro từ callus trên môi
trƣờng có bổ sung 2,4-D, TDZ, BA kết quả cho thấy ngoài sự hình thành callus, chồi
trên môi trƣờng có bổ sung (2,4-D = 0; 3.3mg/l; 10mg/l) và (TDZ = 0; 0.1mg/l;
0.33mg/l) còn có sự phát sinh phôi soma trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 5.0mg/l
hoặc TDZ = 1mg/l).
Tiếp theo đó, Huan, L.V.T và Tanaka, M (2004) đã nhân giống in vitro từ
protocorm trên môi trƣờng có bổ sung NAA và TDZ.
Những hƣớng nghiên cứu trên đã từng bƣớc khẳng định vai trò quan trọng của
Cymbidium và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này.

2.4.2. Giống lan Dendrobium
Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất điều hòa
sinh trƣởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,… vào môi trƣờng nuôi cấy
nhằm đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao. Theo Nayak et al. (1998), Vij et al.
(1994), Sheelavantmath et al. (2000), Lee et al. (1999) đã tìm thấy ảnh hƣởng lớn
trong quá trình nhân giống in vitro khi bổ sung kết hợp vào môi trƣờng nuôi cấy BA
và NAA. Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy thân giả hành của giống lan Dendrobium
moschatum trên môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0,
0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l;
3.0mg/l) và kết quả thu đƣợc cao nhất tại môi trƣờng có bổ sung BA = 3.0mg/l và
NAA = 2.0mg/l là 8.4 protocorm.
Năm 2003, Nasiruddin và ctv đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan

- Phôi hình tim.
- Phôi thủy lôi.
- Phôi lá mầm.
Hình 2.4: Các loại phôi soma.
Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Hình lá mầm

33
2.5.1.5. Vai trò
- Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn
thực vật bằng bioreactor.
- Tạo hạt nhân tạo.
- Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật.
- Công nghệ nuôi cấy tế bào trần.
Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium.

2.5.2. Giới thiệu về protocorm
2.5.2.1. Khái niệm
Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và đƣợc phát triển từ phôi hoặc từ nuôi


35
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2
O 440 mg/l
2. Khoáng vi lƣợng H
3
BO
3
6.20 mg/l
MnSO
4
. 4H
2
O 22.3 mg/l
CoCl
2
. 6H
2
O 0.025 mg/l
CuSO
4
. 5H
2
O 0.025 mg/l
ZnSO
4
. 4H
2
O 8.60 mg/l
Na
2
MoO

3.2. Phƣơng pháp
3.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi
giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu
nhiên, 3 lần gặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy.
3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium.
a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in
vitro của giống lan Cymbidium.
- Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức.
Nghiệm thức
MS
BA (mg/l)
NAA (mg/l)
1
½
0
0
2
½
1
0
3
½
3
0
4
½
5
0
5

37

b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in
vitro của giống lan Cymbidium.
- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức.

Nghiệm thức
MS
TDZ (mg/l)
NAA (mg/l)
1
½
0
0
2
½
0.05
0
3
½
0.1
0
4
½
0.5
0
5
½
1
0

38
3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium.

a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in
vitro của cây lan Dendrobium.
- Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức.

Nghiệm thức
MS
BA (mg/l)
NAA (mg/l)
1
½
0
0
2
½
1
0
3
½
3
0
4
½
5
0

- Số mẫu cấy: 297. 39
b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in
vitro của giống lan Dendrobium.
- Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức.

Nghiệm thức
MS
TDZ (mg/l)
NAA (mg/l)
1
½
0
0
2
½
0.05
0
3


3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi.
3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy.
Quan sát số lƣợng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các
mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium:
a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy.
b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy.
c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy .
d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi.
40
3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy.
Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các
mẫu cấy.
a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy.
b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi.
c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi.
d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi.

3.2.4. Phân tích thống kê.
Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Microsoft Excel
và chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA)
để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để
đánh giá kết quả thí nghiệm.