1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƢỞNG
ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA HAI
GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ CYMBIDIUM
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. TRẦN THỊ DUNG TRẦN QUANG HOÀNG
3
TÓM TẮT KHOÁ LUẬN
TRẦN QUANG HOÀNG, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005.
"ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA 2 GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ
CYMBIDIUM"
* Giáo viên hƣớng dẫn:
Ts. Trần Thị Dung
Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 15/03/2005 đến ngày 15/06/2005, tại phòng nuôi cấy
mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Đối tƣợng nghiên cứu:
- Là 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Đây là những giống lan đƣợc trồng
nhiều ở Việt Nam và đem lại lợi nhuận kinh tế cao.
Mục đích nghiên cứu:
- Sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng BA, TDZ, NAA ở các nồng độ khác
nhau bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm xác định tỉ lệ thích hợp nhất để đạt đƣợc
kết quả nhân giống in vitro cao trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium.
Phƣơng pháp nghiên cứu:
- Trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại.
Kết quả đạt đƣợc:
- Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 1mg/l TDZ và 0.5mg/l NAA cho thấy khả
năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao nhất trên cả 2 giống lan.
- Môi trƣờng nuôi cấy có kết hợp giữa chất điều hoà sinh trƣởng BA và NAA
hoặc TDZ và NAA cho thấy kết quả hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao hơn
so với sử dụng riêng lẽ chất điều hoà sinh trƣởng sinh trƣởng BA hoặc TDZ.
2.1.3.1. Phân loại ................................................................................................... 7
2.1.3.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 7
2.1.3.3. Điều kiện sinh thái .................................................................................... 8
2.2. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan ................................................................. 11
2.2.1. Giao phấn ...................................................................................................... 11
2.2.2 Phƣơng pháp chiết tách ................................................................................. 11
5
2.2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro ....................................................................................11
2.2.3.1. Lịch sử .................................................................................................... 11
2.2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro ............................................................. 12
2.2.3.3. Tiến trình nhân giống in vitro ................................................................. 14
2.2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro ....................................... 14
2.2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ....................................................... 15
2.3. Vai trò các chất điều hòa sinh trƣởng ................................................................. 16
2.3.1. Auxin ............................................................................................................ 16
2.3.1.1. Lịch sử phát hiện ra auxin ....................................................................... 16
2.3.1.2. Giới thiệu về NAA .................................................................................. 17
2.3.1.3. Vai trò của auxins ................................................................................... 17
2.3.2. Cytokinin ...................................................................................................... 18
2.3.2.1. Lịch sử phát hiện ra cytokinin ................................................................ 18
2.3.2.2. Giới thiệu về BA ..................................................................................... 18
2.3.2.3. Giới thiệu về TDZ ................................................................................... 19
2.3.2.4. Vai trò của cytokinin .............................................................................. 19
2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và
Cymbidium ................................................................................................................... 19
2.4.1. Giống lan Cymbidium ................................................................................... 19
2.4.2. Giống lan Dendrobium ................................................................................. 20
2.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm ............................................................... 21
2.5.1. Giới thiệu về phôi soma ................................................................................ 21
2.5.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 21
4.3. Nhận xét chung ................................................................................................... 51
4.3.1. So sánh giữa các môi trƣờng nuôi cấy in vitro lên sự hình thành phôi soma,
protocorm và chồi trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium .................................. 51
4.3.2. So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi giữa 2 giống lan
Dendrobium và Cymbidium ......................................................................................... 52
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 55
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 55
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 56
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 58
7
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng ...................................................................................................................... Trang
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,
tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Cymbidium
sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ........................................................................ 30
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển
của chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro .............................. 33
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,
tạo protocorm và hình thành chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi
cấy in vitro ................................................................................................... 35
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển
chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ..................................... 38
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma,
tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Dendrobium
sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ....................................................................... 40
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển
chồi lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................... 43
Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................................ 53
Biểu đồ 4.6: So sánh sự phát triển chiều cao giữa 2 giống lan Dendrobium và
Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................................ 54
9
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình ................................................................................................................. Trang
Hình 4.12: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro
trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA .................................................... 45
Hình 4.13: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro
trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 48
Hình 4.14: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro
trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 48
Hình 4.15: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro
trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 50
Hình 4.16: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro
trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 50 12
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay hoa kiểng không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh
thần mà còn ảnh hƣởng sâu xa đến tâm hồn con ngƣời và làm đẹp cho cảnh quan môi
trƣờng, do đó quan tâm phát triển hoa kiểng là vấn đề cần thiết. Bên cạnh đó lan là
một trong những loại hoa đƣợc ƣa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thƣớc
phong phú và đa dạng nên chúng đƣợc sản xuất khá phổ biến.
Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng.
Các nƣớc có truyền thống sản xuất hoa lan nhƣ Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan...,
hàng năm thu đƣợc hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan. Ở Việt Nam
hoa lan là một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao.
Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có đủ điều
kiện thuận lợi cho cây lan phát triển nhƣ: ẩm độ, nhiệt độ, cƣờng độ ánh sáng…., đặc
biệt là thích hợp đối với các nhóm lan: Dendrobium, Cymbidium, Oncidium,…. .Nên
vừa qua sở Nông nghiệp-Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức hội
thảo về hiện trạng và hƣớng phát triển hoa lan trên địa bàn, nhằm đƣa cây hoa lan
thành cây chủ lực trong cơ cấu nông nghiệp của thành phố (ĐCSVN, 27/6/2005).
Việc sản xuất hoa lan ở nƣớc ta hiện nay chỉ mới đáp ứng đƣợc nhu cầu thấp
chủ yếu phải nhập từ các nƣớc khác nhƣ: Thái Lan, Đài Loan….Trƣớc tình hình trên
và cũng nhằm đƣa tiến bộ của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào vào công tác giống, góp
14
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan
2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.1.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới
Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng và
đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao:
*Ở Châu Âu:
- Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành
lan Dendrobium.
- Holland là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất
khẩu, do trồng trong nhà kính nên Holland có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là
Cymbidium.
- Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, nhập
75,3 triệu cành, chủ yếu từ các nƣớc: Thái Lan, Holland , Singapore ….
- Đức và Pháp là hai quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và thứ 3 Châu Âu.
*Ở Châu Á:
- Nhật là quốc gia nhập khẩu đứng đầu thế giới. Theo thống kê, tại Thái Lan,
*Tại Đà Lạt:
- Cây lan Cymbidium đã đƣợc nuôi trồng tại Đà Lạt từ rất lâu, chủ yếu để tiêu
khiển. Tại đây, ngoài những loài tự nhiên, các biến chủng, còn có nhiều giống nhập
nội nuôi trồng.
- Từ năm 1977, sau khi thành lập tổ Hoa Lan Xuất Khẩu, phong trào trồng lan
đã đƣợc phát triển mạnh.
- Đến năm 1985, đã xuất khẩu đƣợc trên 15.000 cành hoa Cymbidium.
- Hiện nay nhu cầu hoa lan đang tăng nhanh, trong khi đó mức độ phát triển
còn hạn chế. Đó là do chƣa có những đầu tƣ nghiên cứu về đối tƣợng này nhƣ: vấn đề
khoa học, chọn tạo giống và kỹ thuật nuôi trồng…do đó không thể hiểu rõ và đánh giá
đúng đắn tiềm năng và triển vọng nguồn lợi này.
- Xu hƣớng hiện nay đang tập trung vào các giống nhập nội, còn lại các loại
lan nội địa ít đƣợc chú ý. Mặc dù các loài biến chủng nội địa có giá trị rất cao, có thể
đáp ứng đƣợc nhu cầu xuất khẩu. Nhƣ vậy cơ sở để phát triển nghề trồng lan xuất
khẩu vẫn phải chú trọng vào cây lan nội địa, nhất là chọn tạo giống mới từ cây lan nội
(Trích Dƣơng Ngọc Bích Quyên, 2002).
16
2.1.2. Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium
2.1.2.1. Phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, ngƣời ta đã xếp riêng
Cymbidium vào một chi (Otto Swartz, 1799). Trong khóa phân loại của
Lindley - Bentham - Brieger năm 1983, chi Cymbidium thuộc tông phụ Cymbidinae,
tông Dendreae, phân họ Orchidoideae.
Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dƣơng, từ năm 1932, Henri Lecompte cho
rằng chi này có 120 loài. Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp lại và xác định có
khoảng 60 loài.
Theo những nhà phân loại học Việt Nam nhƣ Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi...
đã giới thiệu ở nƣớc ta có khoảng 12 loài:
- Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội).
- Cymbidium cyperifolium (thanh lan).
luôn phiên theo đƣờng xoắn ốc.
- Hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ
gọi là trục hợp nhụy, hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Nhị ở trên cùng, mang
2 khối phấn màu vàng, có gót dính nhƣ keo. Khối phấn đƣợc đậy bởi một nắp màu
trắng ngà dễ mở rời, cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên do hoa Cymbidium chỉ thụ
phấn đƣợc nhờ côn trùng.
- Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả.
Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín, quả
mở theo 3 đƣờng góc và gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa.
Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia,
hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới.
2.1.2.3. Điều kiện sinh thái
Cymbidium có những tính chất rất đặc biệt: thời gian ra hoa dài (trung bình 12
tháng), khả năng phát triển rất mạnh, có hình dáng, màu sắc, kích thƣớc phong phú và
đa dạng.
Các loài Cymbidium sống trong môi trƣờng mát cây cần nhiều ánh sáng trong
suốt thời gian trong năm, nhƣng cây không chịu đƣợc ánh sáng trực xạ nên phải che
bóng để giữ độ chiếu sáng thích hợp.
Cymbidium cần nhiều nƣớc trong mùa sinh trƣởng, cần tƣới nƣớc nhẹ nhàng và
thƣờng xuyên bón phân đầy đủ, từ lúc cây phát triển cũng nhƣ lúc ra hoa và phân chia
các khóm giả hành.
18
Về nhiệt độ: loài lan này sống trong môi trƣờng lạnh nên có chế độ nhiệt rất
đặc biệt: 15
0
C vào mùa đông và 20
0
C vào mùa hè, biên độ ngày và đêm từ 6 - 7
0
2.1.3.2. Đặc điểm hình thái
- Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật đƣợc bao bọc bởi một lớp mô
xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời
19
gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô
xốp nên có thể giúp cây quang hợp.
- Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình
múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống.
- Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang và các gân
lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng.
- Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những
chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài
cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa đƣợc tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1
trụ hoa). Cột nhị nhụy ngắn.
2.1.3.3. Điều kiện sinh thái
Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, ngƣời ta chia làm 2 hai nhóm
chính:
- Nhóm ƣa lạnh: nhiệt độ lý tƣởng là 15
0
C sống chủ yếu ở vùng cao nguyên
trên 1000m. Những loài lan này có thể ra hoa ở nhiệt độ cao.
- Nhóm lan ƣa nóng: nhiệt độ thích hợp nhất là 25
0
C. Ngoài ra còn có giống lan
thích hợp ở nhiệt độ 20
0
C có thể ra hoa ở vùng nóng và vùng lạnh.
- Ẩm độ: thích hợp ở ẩm độ 50 - 70%
- Ánh sáng: có thể nói Dendrobium là loài ƣa sáng (60 - 70%), có những loài
Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium.
21
Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium.
22
2.2. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan
2.2.1. Giao phấn
Nhƣ đã nói, giao phấn trong tự nhiên là hiện tƣợng thông thƣờng, gần nhƣ bắt
buộc đối với hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lƣợng chủng
loại rất phong phú. Đó cũng là phƣơng thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ƣu thế hơn
cả của họ thực vật này trong hƣớng thụ phấn nhờ côn trùng.
Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính
hơn hẳn cây bố mẹ.
2.2.2 Phƣơng pháp chiết tách
- Phƣơng pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số
lƣợng cây mới.
- Các giả hành già đƣợc tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng đƣợc
từ 2 - 3 năm. Giả hành già đƣợc ƣơm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con
đƣợc nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách
lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con.
- Phƣơng pháp chiết tách đảm bảo đƣợc tính chất di truyền của cây bố mẹ
nhƣng lại cho một thế hệ cây con sinh trƣởng không đồng đều nên khó cung cấp một
số lƣợng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn.
2.2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro
2.2.3.1. Lịch sử
- Năm 1838, hai nhà sinh học ngƣời Đức Schleiden và Schwann đã đề xƣớng
thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế
bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế
bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây
chồi nách thƣờng xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba …. . Khi các
cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trƣờng
mới.
Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách đƣợc áp dụng cho bất kỳ cây cây
trồng sản xuất chồi nách bình thƣờng và phản ứng với cytokinin nhƣ: BAP, Zip &
Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee).
24
*Nhân giống bằng chồi đỉnh
Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và
việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Kích thƣớc đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm – 0.5 mm)
thƣờng khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhƣng nó lại quan trọng trong việc phát triển
nguyên liệu gốc sạch bệnh. Những kích thƣớc đỉnh chồi từ 0.5 mm – 2 mm thì thông
dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983).
Thƣờng nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trƣờng có chứa auxin kết hợp với
cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền .
*Nhân giống bằng chồi bất định
Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây
trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thƣờng. Một số các nguyên liệu nuôi cấy gồm: lá,
vẩy, cuống lá ……
Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt
cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới
mô mạch của mẫu cấy. Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị.
*Nhân giống qua nuôi cấy callus
Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan
hay phôi) là phƣơng pháp nhân giống in vitro có khuynh hƣớng cho giá trị thấp. Nuôi
cấy callus và tế bào đơn cho tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh.
*Nhân giống bằng các đoạn giả hành
bên ngoài đƣợc thiết lập để thuần hoá cây in vitro.
*Giai đoạn 4: trồng cây in vitro ngoài đồng ruộng
Cây con đƣợc tiếp tục nhân giống trên luống ƣơm và đƣợc cấy vào bầu đất rồi
chuyển ra trồng trên đồng ruộng.
2.2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro
*Sự lựa chọn mẫu cấy
Mẫu cấy phải cạnh tranh sinh lý để sống sót trong môi trƣờng nuôi cấy sơ khởi
và tạo phản ứng thích hợp. Mẫu cấy còn non sẽ tái sinh tốt hơn mẫu già.
Mẫu thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có tỉ lệ mô phân sinh hiện diện hay
những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng.
*Môi trƣờng nuôi cấy
Thông thƣờng là môi trƣờng Murashige & Skoog là thích hợp cho phần lớn các
trƣờng hợp. Để hình thành chồi nách yêu cầu nồng độ thấp của auxin và cytokinin, để
Copyright: Tài liệu đại học ©