ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM
VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM
VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số: 60.42.70


thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em
trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện
Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình
lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách
trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thị Minh

Chuyên ngành Di truyền học

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa

i

Lời cảm ơn

ii


1.5.7. Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng ... 19
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................... 20
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 20
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................... 20
2.1.2. Hoá chất............................................................................................ 20
2.1.3. Thiết bị ............................................................................................. 20

Chuyên ngành Di truyền học

i

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

2.1.4. Môi trường nuôi cấy ......................................................................... 20
2.1.4.1. Môi trường Broth Peptone.......................................................... 20
2.1.4.2. Môi trường I ............................................................................... 20
2.1.4.3. Môi trường II .............................................................................. 21
2.1.4.4. Môi trường III ............................................................................. 21
2.1.4.5. Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium ................... .21
2.1.4.6. Môi trường nuôi lắc lông vũ ...................................................... 21
2.1.4.7. Môi trường MPA ........................................................................ 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 22
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao .............. 22
2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất ................................................................. 22
2.2.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium .............................. 22

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 41
3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm ............................................................ 41
3.2. Giá trị pH của các mẫu đất.................................................................... 41
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin ..... 42
3.4. Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc............. 44
3.5. Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc ................................ 47
3.6. Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ ......................... 48
3.7. Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn ................................... 49
3.8. Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá ................... 50
3.8.1. Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 ....... 50
3.8.2. Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 ........... 51
3.9. Phân loại theo kiểu gene ....................................................................... 52
3.9.1. Tách DNA tổng số ........................................................................... 52
3.9.2. Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR ................. 53
3.10. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a ................. 55
3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR .......................... 55
3.10.2. Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách
dòng pET32a ........................................................................................... 56
3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B ................... 58
3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp ..................................................... 59
3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc ................... 60
3.11.1. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford ....................... 60
3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin ....................................... 62
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 64
4.1 Kết luận .................................................................................................. 64
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 65

Chuyên ngành Di truyền học


LB

Luria-Bertani

Ker

Keratinase

bp

Base pair(cặp ba zơ)

E.coli

Escherichia coli.

µl

Microlit

EtOH

Ethanol

Primer-F

Mồi xuôi

Primer-R



16

2.1

49 phép thử lên men API 50 CHB

28

2.2

50 phép thử sinh hóa API 20 CHB

31

3.1

Địa điểm lấy mẫu

41

3.2

Giá trị pH của các mẫu đất

41

3.3

Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn

3.8

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA

61

3.9

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) và hàm lượng

62

protein của dịch nổi vi khuẩn
3.10

Kết quả xác định hoạt tính enzyme keratinase

Chuyên ngành Di truyền học

v

63

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh


7

3.1

Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc

44

(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.2

Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

46

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau
(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.3

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

46

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày
nuôi cấy lắc)
3.4

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

48


Sản phẩm PCR bằng mồi ker F và ker R

56

3.10

Sản phẩm thôi gel tinh sạch gene ker

56

Chuyên ngành Di truyền học

vi

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

3.11

HVCH: Nguyễn Thị Minh

Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

57

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt
3.12

Chuyên ngành Di truyền học

vii

61

Lớp Sinh K17


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....