Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

VƢƠNG THANH HƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus
stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG
KHÁNG SINH TRONG SỮA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2017

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

VƢƠNG THANH HƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus
stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG
KHÁNG SINH TRONG SỮA
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

sinh trong thực phẩm từ vật nuôi này vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần.
Trong ngành sản xuất sữa hiện nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng
và chữa bệnh cho bò (phổ biến là bệnh viêm vú bò) là nguyên nhân gây ra sự tồn dư
thuốc kháng sinh trong mô và trong sữa của bò. Kháng sinh tồn dư trong sữa bò, dê,
cừu gây ức chế vi khuẩn được dùng trong quá trình chế biến sữa, đặc biệt là quá
trình chế biến phomat, sữa chua khi phải dùng vi khuẩn để lên men. Đồng thời sự
tồn dư lượng kháng sinh trong sữa gây nguy hiểm cho trẻ em và người già, là những
đối tượng dùng sữa nhiều.
Các nước Châu Âu đã ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm
2006. Mỹ và Thái Lan sẽ ngừng sử dụng trong năm 2017. Quốc tế đã có rào cản của
riêng mình để nói không với thực phẩm chứa kháng sinh. Ở Việt Nam, vấn đề kiểm
tra và kiểm soát dư lượng kháng sinh trong sữa đang được quan tâm. Trước đòi hỏi
ngày càng cao về chất lượng và độ an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ đồng

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 3 of 126.

1

Lớp: K23-QH2014


Header Page 4 of 126.

Luận văn thạc sỹ
vật của con người, ngoài việc tăng cường quản lý các công đoạn sản xuất thì việc
xác định nhanh hàm lượng kháng sinh tồn dư trong thực phẩm là điều rất cần thiết.
Có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa
như phương pháp sắc ký, phương pháp sắc ký miễn dịch, phương pháp ELISA,...
Các phương pháp này hầu hết có độ nhạy cao, kết quả khá chính xác. Tuy nhiên quy

1.1. Tình hình sản xuất sữa tƣơi ở Việt Nam:
Là quốc gia đông dân với mức tăng trưởng dân số cao, khoảng 1,2%/năm,
Việt Nam được đánh giá là thị trường tiềm năng cho các hãng sản xuất sữa. Với tỷ
lệ tăng trưởng GDP 6-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm cùng
với xu hướng cải thiện sức khỏe và tầm vóc của người Việt khiến nhu cầu sử dụng
các loại sữa và các sản phẩm từ sữa luôn ở mức cao. Theo dự báo của Hiệp hội Sữa
Việt Nam (VDA), lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người tại Việt Nam vào năm
2010 đạt 15 lít/năm và sẽ tăng gần gấp đôi, lên mức 28 lít/năm vào năm 2020 [15].
Tăng trưởng doanh thu ngành sữa chủ yếu là sữa bột và sữa nước, chiếm 74% tổng
giá trị thị trường. Tuy nhiên, năng lực sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa trong
nước được dự báo sẽ không theo kịp nhu cầu tiêu thụ, đặc biệt là trong lĩnh vực sản
xuất sữa tươi. Lượng sữa tươi nguyên liệu trong nước chỉ đáp ứng được 30% nhu
cầu sử dụng [15]. Trong khi đó, chất lượng sữa thấp, không ổn định do nguồn cung
cấp chủ yếu từ các hộ chăn nuôi nhỏ, năng suất thấp.
Nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường, ngày càng có nhiều
doanh nghiệp tham gia vao ngành chế biến sữa Việt Nam. Đặc biệt, đa phần các
doanh nghiệp hiện đang tập trung đầu tư phát triển vùng nguyên liệu của riêng mình
dưới nhiều hình thức nhằm giải quyết được nhược điểm lớn nhất của ngành sữa Việt
Nam là thiếu hụt nguyên liệu. Một trong những doanh nghiệp sữa thành công nhất
với việc tạo lập vùng nguyên liệu để phát triển sản phẩm là Công ty Cổ phần sữa
TH (nhãn hiệu sữa TH true milk). Các doanh nghiệp khác cũng không đứng ngoài
cuộc đua phát triển vùng nguyên liệu như Công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk,
Công ty cổ phần Thực phẩm dinh dưỡng NutiFood Việt Nam, … Sức hấp dẫn của
thị trường sữa Việt Nam không chỉ kích thích các doanh nghiệp nội địa mở rộng sản
xuất mà còn thu hút nhiều nhà đầu tư nước ngoài bỏ vốn vào ngành. Ví dụ, doanh
nghiệp sữa Friesland Campina Việt Nam (nhãn hiệu sữa Cô gái Hà Lan) đang xúc
tiến đẩy mạnh phát triển vùng nguyên liệu tại tỉnh Hà Nam theo hình thức hợp tác
Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 5 of 126.


Header Page 7 of 126.

Luận văn thạc sỹ
1.2. Tình hình sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi:
1.2.1. Trên thế giới:
Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản, không chỉ để phòng và trị bệnh mà còn được dùng như một chất kích thích
sinh trưởng ở liều thấp (2,5 - 50 ppm) [8,52]. Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò sữa nói riêng là rất lớn. Việc sử dụng
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của
Stokstad và Juke năm 1949 [65] khi cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung
Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của gia
cầm tăng rõ rệt. Vì thế, người ta đã đưa vào thức ăn của gia súc, gia cầm nhiều loại
thuốc kháng sinh như Oxytetracycline, Aureomycine, Penicillin, Streptomycine.
Mỹ là nước đầu tiên phát hiện ra hiệu quả sử dụng kháng sinh làm chất kích
thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi. Ở Mỹ hàng năm có khoảng 6 triệu pao
(xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi. Theo thống kê, xấp xỉ
80% số gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt được nuôi dưỡng bằng thức
ăn có bổ sung kháng sinh. Ước tính cứ mỗi USD chi phí cho kháng sinh dùng trong
thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2-4 USD [33]. Cơ quan quản lý Dược
phẩm và Thực phẩm (FDA) Mỹ đã ban hành các quy định về việc cho phép sử dụng
kháng sinh để kích thích tăng trọng từ năm 1951. Theo Hội đồng nghiên cứu Quốc
Gia Hoa Kỳ (NRC), 1998, Mỹ và Canada đã cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh
vào thức ăn cho lợn, trong đó có 8 loại phải ngừng sử dụng trước khi giết mổ từ 570 ngày. Liều lượng bổ sung thường rất thấp tùy theo loại kháng sinh, nhưng nếu sử
dụng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin thì hàm lượng đó là 30 đến 40 ppm. [33]
Ở Anh và Pháp, trung bình một năm có khoảng 75% số động vật được dùng
kháng sinh để điều trị và gần 60% động vật được dùng kháng sinh để phòng bệnh.
Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào
thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh [52]. Theo số liệu của
Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn

[17,22,28]. Do phát hiện ra những độc tính của Chloramphenicol (CAP) lên cơ quan
tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy, gây tử
vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng CAP trong thú y. [3]
1.2.2. Tại Việt Nam:
Ở Việt Nam kháng sinh được sử dụng tràn lan để phòng bệnh và trị bệnh nên
tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt và sữa là rất phổ biến. Có tới 60-70% tổng
các thuốc đang dùng để phòng trị bệnh cho vật nuôi là thuốc hóa học trị liệu trong
đó chủ yếu là thuốc kháng sinh [16]. Theo Lã Văn Kính và cộng sự (2007), tỷ lệ sử
dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta là rất cao: 100% các cơ sở chăn nuôi có
sử dụng Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Chloramphenicol

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 8 of 126.

6

Lớp: K23-QH2014


Header Page 9 of 126.

Luận văn thạc sỹ
(mặc dù thuốc này đã bị cấm không được dùng để điều trị), 30% có sử dụng
Olaquindox, 77% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Dexamethasol [12,13].
Công bố nghiên cứu của khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh có 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi
sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa
bệnh cho gia súc cho đến khi nào bán được. Kết quả khảo sát tình hình sử dụng
kháng sinh trong chăn nuôi gà trên địa bàn tỉnh Bình Dương cho thấy có 26 loại
kháng sinh đã được sử dụng. Trong đó, loại được sử dụng nhiều nhất là

Luận văn thạc sỹ
Các bệnh của bò thường được điều trị bằng kháng sinh như bệnh nhiễm
khuẩn nặng, viêm vú, viêm tử cung, viêm phổi, viêm móng, khớp, tiêu chảy,… Kết
quả nghiên cứu của Sa Đình Chiến và Cộng sự [4] cho thấy bệnh viêm vú đang gây
thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Tỷ lệ viêm vú lâm sàng của bò sữa mới nhập
vào địa bàn Mai Sơn, Sơn La là 27,46 %, viêm vú phi lâm sàng là 48,16 %. Có
nhiều nguyên nhân dẫn đến phát sinh phát triển bệnh viêm vú. Kháng sinh được sử
dụng để điều trị bệnh viêm vú bò sữa là: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin,
Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin.

Hình 1.2. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi trên địa bàn tỉnh
Bình Dương [18]

1.3. Tồn dƣ chất kháng sinh trong thực phẩm:
Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7405:2004 [1] về sữa tươi nguyên liệu - yêu
cầu kỹ thuật cho phép giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y như sau:

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 10 of 126.

8

Lớp: K23-QH2014


Header Page 11 of 126.

Luận văn thạc sỹ
Bảng 1.1. Giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh cho phép trong sữa


- Dicloxacillin

30

- Cephalexine

100

- Ceftiofur

100

- Gentamicin

100

- Tetracylin

100

- Oxytetracyllin

100

- Chlortetracyllin

100

- Sulfonamin


kháng sinh.
- Kháng sinh có thể tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi do sử dụng thường
xuyên trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trọng cho gia súc (liều thấp)
hoặc cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh (liều trung bình).
- Kháng sinh có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi
sinh vật, để bảo quản thực phẩm.
- Kháng sinh sử dụng để chữa bệnh cho gia súc (liều cao).
1.3.2. Tác hại:
1.3.2.1. Nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng:
- Gây dị ứng, phản ứng quá mẫn: Theo các báo cáo về y tế, Penicillin là kháng
sinh thường gây dị ứng nhất. Kết quả nghiên cứu của Jones đã chỉ ra rằng có
khoảng 5-10% dân số mẫn cảm đối với Penicillin hoặc kháng sinh khác với biểu
hiện dị ứng da, mệt mỏi, nôn, thậm trí sốc ngay ở nồng độ thấp (1ppb) [48]. Đã có
trường hợp người bị nổi mẫn da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng Penicillin (
là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường.
1.3.2.3. Nguy cơ đối với công nghệ chế biến bảo quản thực phẩm:
Chất kháng sinh có thể gây trì hoãn sự khởi đầu tích cực của các vi sinh vật
có lợi trong sản xuất bơ, phomat, sữa chua chỉ với nồng độ 1ppb. Kháng sinh còn
Hv: Vương Thanh Hương

Footer Page 13 of 126.

11

Lớp: K23-QH2014


Header Page 14 of 126.

Luận văn thạc sỹ
làm giảm bớt mùi, vị và độ axit trong các sản phẩm, làm giảm quá trình đông tụ của
sữa, đồng thời nó cũng là nguyên nhân không thể chấp nhận được với sự chín muồi
của phomat [48]. Sự có mặt của kháng sinh trong thịt gây nên những tác dụng ngoài
mong muốn trong sản xuất xúc xích và các sản phẩm lên men thịt khác.
Người tiêu dùng khó nhận biết được những sản phẩm có tồn dư kháng sinh
nếu không có chuyên môn. Vấn đề này cần phải được bắt đầu giải quyết từ quy
trình nuôi gia súc, gia cầm. Khi đó sẽ cải thiện được chất lượng của thực phẩm chế
biến từ động vật cũng như tránh được tình trạng kháng kháng sinh cho người. Do đó
cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng thuốc kháng sinh trong thực
phẩm để hạn chế được những tác dụng nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng
thuốc kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép.
1.4. Các phƣơng pháp phát hiện dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa:
Hiện nay, việc phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có
nguồn gốc từ động vật) rất đa dạng, trong đó tập trung vào các phương pháp chính

trong các mẫu sữa [68], xác định được dư lượng kháng sinh Sulfamethazine ở 3
trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với
giới hạn cho phép [26]. Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng
kháng sinh Cefotaxime và Cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng
là 0,1 và 0,3 ng/ml [64]. Tác giả W. Hela và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp
HPLC với detector DAD để xác định 12 kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid (SAs)
trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà).
Tại Việt Nam, TCVN 8345- 2010 [2] qui định phương pháp xác định 10 SAs
trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa
Cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác
như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh
trong các mẫu phân tích. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản
xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [40].

Hình 1.3. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 15 of 126.

13

Lớp: K23-QH2014


Header Page 16 of 126.

Luận văn thạc sỹ
1.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS):
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách

Header Page 17 of 126.

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.4. Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
1.4.1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là
chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp
mỏng đồng nhất và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại. Pha động là
một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định
trong từng mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử
trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như
sữa, mật ong, thịt, cá, … Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện
của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được
lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với Streptomycin, Kanamycin,
Gentamycin [53], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone-MethanolAmmonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform-MethanolAmmonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline.

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 17 of 126.

15

Lớp: K23-QH2014


Header Page 18 of 126.


Hv: Vương Thanh Hương

Footer Page 18 of 126.

16

Lớp: K23-QH2014


Header Page 19 of 126.

Luận văn thạc sỹ
Nhược điểm: Cần có trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được
đào tạo chuyên sâu.
1.4.3. Phương pháp sàng lọc (screening method)
Đây là phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc
một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và mẫu
không đạt yêu cầu vệ sinh. Phương pháp này thường được thiết kế để tránh tối đa
kết quả âm tính giả. Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc
thường được tiến hành trước khi định danh và định lượng chính xác.
1.4.3.1. Phương pháp sắc ký miễn dịch
Hiện nay các test nhanh trên cơ sở sắc ký miễn dịch được sử dụng để phát
hiện nhanh và tương đối chính xác các loại kháng sinh trong sữa ngay tại địa điểm
thu mua, cho kết quả trong thời gian ngắn (khoảng 1-2 phút). Test thường ở dạng
que thử, được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Que thử dạng sắc kí
miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại test thử nhanh dạng sắc ký miễn
dịch như:
- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc nhóm -lactam của
hãng Ar Brown - Nhật Bản cho kết quả sau 5 phút với độ nhạy từ 3-20 ppb tùy từng

ứng giữa kháng nguyên - kháng thể đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được
cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng
lọc. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dựa trên phản
ứng giữa kháng nguyên - kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng,
enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã
xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ
màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp ELISA có khả năng phát hiện hầu hết những chất kháng sinh
thường có mặt trong thực phẩm như nhóm Beta-lactams, nhóm Chloramphenicol,
nhóm Macrolides, nhóm Tetracyclines, nhóm Aminoglycosides, nhóm Sulphonamides.

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 20 of 126.

18

Lớp: K23-QH2014


Header Page 21 of 126.

Luận văn thạc sỹ
Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp
ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những
yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ
dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Abhishek Gaurav và cộng sự [38] đã
nghiên cứu trên 133 mẫu sữa thu thập được từ nhà sản xuất sữa thuộc 5 huyện của
Punjab, Ấn Độ vào tháng 5/2013 và đã thử nghiệm, phân tích tình trạng tồn dư
kháng sinh Tetracycline. Kết quả cho thấy có 18 mẫu sữa có tồn dư Tetracycline.

Header Page 22 of 126.

Luận văn thạc sỹ
phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định
lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) [7].
Ưu điểm:
Phương pháp ELISA có ưu điểm: nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện;
không đòi hỏi thiết bị đắt tiền; không cần nhân viên chuyên môn cao; chi phí thử
nghiệm mẫu thấp do có thể thử nghiệm đồng thời số lượng mẫu lớn; một bộ kit có
thể phân tích được 50-80 mẫu.
Nhược điểm:
Một số hóa chất trong bộ kit phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định;
độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký do
đó phương pháp này chỉ thích hợp với các phân tính sàng lọc hơn là các phân tích
định lượng.

Hình 1.6. Hệ thống phân tích ELISA
1.4.3.3. Phương pháp sử dụng vi sinh vật:
Để kiểm tra dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm có nguồn gốc
động vật, phương pháp xác định dựa vào quá trình ức chế sự sinh trưởng của vi sinh
vật thường được sử dụng [57,55]. Phương pháp dựa trên sự ức chế vi sinh vật của
chất kháng sinh nhờ việc hình thành vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Người ta có thể
sử dụng mẫu đặt trực tiếp lên đĩa thạch hoặc dùng dung dịch chiết tách từ mẫu nhỏ
vào khoanh giấy thấm rồi đặt lên đĩa thạch.

Hv: Vương Thanh Hương
Footer Page 22 of 126.

20



21

Lớp: K23-QH2014


Header Page 24 of 126.

Luận văn thạc sỹ
kết quả của thử nghiệm này đã được sử dụng [51]. Ferrini et al. [35] đã nghiên cứu
phương pháp sáu tấm, bao gồm 4 tấm ở trên có bổ sung thêm tấm chứa vi khuẩn B.
cereus và tấm có vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu trên đã cho phép xác định được
nhóm kháng sinh trong sữa và sàng lọc ban đầu chỉ trong một bước.
Khả năng phát hiện tốt nhất đối với các kháng sinh nhóm β-lactam là các
chủng Geobacillus stearothermophilus, Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis,
trong khi đó đối với các kháng sinh macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát
hiện Tetracycline thấp khi sử dụng chủng Bacillus cereus, còn đối với Quinolone là
Escherichia coli và Yersinia ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các
chủng G. stearothermophilus và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng
để phát hiện sự hiện diện của các Aminoglycoside [31].
Ưu điểm:
Trang thiết bị đơn giản, cần ít mẫu; phổ phát hiện rộng, tương đối nhạy (tùy
vào chủng vi sinh vật và môi trường), thời gian phát hiện tương đối nhanh, giá
thành rẻ; có thể tự động hoá, rất tiện để sàng lọc; dễ thực hiện, không cần kỹ thuật
viên tay nghề cao.
Nhược điểm:
Không định lượng được, độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng vi sinh vật
sử dụng. Một số chất kháng sinh như Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidasole
không phát hiện được dù có nồng độ cao do các chủng vi sinh vật không mẫn cảm
với những chất này.

cho sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa khí, ưa nhiệt và hình thành nội bào tử của
thermophiles. Sau khi phân tích các đặc điểm di truyền và sinh lý, các nhà khoa học xác
định chỉ một phần thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus. Sau khi kiểm tra kỹ
lưỡng các loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thái, sinh lý học, và phát sinh loài, họ
thấy nó thuộc một đơn vị phân loại riêng biệt là Geobacillus. Vi khuẩn này đã chính thức
đổi tên Geobacillus stearothermophilus vào năm 2004 [67].
G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân
lập từ một số địa điểm quan trọng tại Hoa Kỳ như: trên gỗ mục nát ở Florida, đất đã
được sử dụng kỹ thuật làm giàu và suối nước nóng ở công viên Quốc gia
Yellowstone. Những địa điểm này thể hiện đặc điểm của nó là một vi khuẩn khử
nitơ, có khả năng sinh trưởng trong các môi trường nóng khác nhau và có tên là
Geobacillus mà chữ “Geo” có nghĩa là trái đất [70].
1.5.1.1. Phân loại:
Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus thuộc: [70]
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales