TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN,
FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016


TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐẶNG MINH HƢƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA ATORVASTATIN,
FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

Chuyên ngành: Hóa môi trƣờng
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Giaoo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kim Thƣờng

Hà Nội – Năm 2016



1.2.2. Dƣợc lực học và động lực học của Fenofibrat ..............................................5
Dược lực học ............................................................................................................5
Dược động học .........................................................................................................5
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT....5
1.3.1. Các phƣơng pháp xác định atorvastin ..........................................................6
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).....................................................6
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................................6
Phương pháp von-ampe ...........................................................................................6
1.3.2. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat ..........................................................7
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ................................................................7
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ....................................................7
Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan ............................................................8
1.4. GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÒA TAN HẤP PHỤ ..........9
1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV) ............9
1.4.2. Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ. ................................11
Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (DP) ..................................................................11

II


Kỹ thuật sóng vuông ..............................................................................................12
CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Thiết bị ......................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Dụng cụ ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Hóa chất ....................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch ...................................... Error! Bookmark not defined.
Pha dung dịch......................................................... Error! Bookmark not defined.

III


3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phƣơng phápError!

Bookmark

not defined.
Khoảng tuyến tính. ................................................. Error! Bookmark not defined.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)Error! Bookmark not
defined.
Độ lặp lại ................................................................ Error! Bookmark not defined.
3.1.3. Áp dụng thực tế phân tích hàm lƣợng atorvastatin trong các mẫu thuốc
trên thị trƣờng. ............................................................ Error! Bookmark not defined.
Phân tích mẫu thuốc Lipivastatin 20mg của công ty cổ phần hóa-dược phẩm
Mekopha ................................................................ Error! Bookmark not defined.
Phân tích mẫu thuốc Avastor (10mg) của công ty cổ phần Dược phẩm Boston
Việt Nam. ............................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.4. Nghiên cứu quy trình định lƣợng atorvastatin trong mẫu huyết tƣơng.
Error! Bookmark not defined.
Khảo sát thành phần hỗn hợp dung dịch rửa tạp. .. Error! Bookmark not defined.
Khảo sát hành phần hỗn hợp dung dịch rửa giải. .. Error! Bookmark not defined.
3.1.5. Xác định hiệu suất thu hồi của atorvastatin trong mẫu huyết tƣơng.Error!
Bookmark not defined.
3.2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG HỖN HỢP
ATORVASTATIN VÀ FENOFIBRAT BẰNG PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE
HÒA TAN HẤP PHỤ ............................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp ..................... Error! Bookmark not defined.
Nghiên cứu đặc tính điện hóa của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat .......... Error!
Bookmark not defined.

Bookmark not defined.
Phân tích đồng thời hàm lượng atovastatin và fenofibrat trong mẫu thuốc. . Error!
Bookmark not defined.
KẾT LUẬN .............................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................13

V


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Tiếng anh

Tiếng việt

Viết tắt

1

Anodic Stripping Voltammetry

Von-ampe hòa tan a-nốt

ASV

Von-ampe hòa tan hấp phụ

AdSV

Cyclic Voltammetry
Differential pulse stripping
Voltammetry
Fenofibrat

Feno

Hanging Mercury Dropping

Điện cực giọt thủy ngân treo

Electrode

HMDE

High Perfomance Liquid

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

Chromatography

năng cao

10

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

11


14
15

Square-Wave Stripping
Voltammetry
Static Mercury Dropping
Electrode
Stripping Voltammetry

VI

HPLC
GPPH
(LOD)


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm-Autolab.Error!

Bookmark

defined.
Hình 3.1: Đường von-ampe vòng của atorvastatin 10-7mol.L-1Error!

not

Bookmark


Bookmark not defined.
Hình 3.11. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế. .............. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.12: Đường von-ampe hòa tan của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7M. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.13. Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-8M đến 10-7MError!

Bookmark

not defined.
Hình 3.14: Đường chuẩn của atorvastatin từ 10-7M đến 10-6 MError!

Bookmark

not defined.
Hình 3.15: Đường von-ampe hòa tan mẫu thuốc mekophaError! Bookmark not
defined.

VII


Hình 3.16. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm
Boston bằng phương pháp thêm chuẩn ..................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.17. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa tạp
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.18. Đường von-ampe phụ thuộc vào thành phần dung dịch rửa giải. .. Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.19. Đường von–ampe hòa tan của atovastatin trong mẫu huyết tương Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.20: Đường CV của atorvastatin và fenofibrat.Error!

độ dòng I.................................................................... Error! Bookmark not defined.

VIII


Hình 3.34: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi nồng độ của hỗn hợp fenofibrat
và atorvastatin. .......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.35. Đường chuẩn của fenofibrat trong khoảng nồng độ từ 10-8M đến 107M.
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.36. Đường chuẩn của atorvastatin trong khoảng nồng độ từ 10-8M đến 107M.............................................................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.37. Đường von-ampe hòa tan khi đo mẫu (10mg) của công ty dược phẩm
SHYT bằng phương pháp thêm chuẩn ...................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.38. Đường von-ampe hòa tan của thuốc Lipistad 300mgError! Bookmark
not defined.
Hình 3.39: Đường von-ampe hòa tan của hỗn hợp Atovastatin 10mg và Fenofibrat
300mg ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

IX


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của pícError!

Bookmark

not

defined.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng pícError!



X


Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ chất phân tích đến cường độ dòng píc .... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.18. Độ lặp lại của hỗn hợp Ato và Feno ....... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.19. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc Avastor bằng phương pháp thêm
chuẩn ............................................................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.20. Cường độ dòng píc khi đo mẫu thuốc bằng phương pháp thêm chuẩn
...................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.21. Cường độ dòng píc khi đo hỗn hợp mẫu thuốc Ato và Feno bằng phương
pháp thêm chuẩn .......................................... Error! Bookmark not defined.

XI


MỞ ĐẦU
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ có
hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người. Theo sự phát triển của
dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 9
năm 2015, cả nước có 171 doanh nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh
nghiệp sản xuất tân dược nhưng chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP – WHO
[1]. Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậm chí, có khi còn lên tới 50% lượng
dược phẩm lưu hành ở một số nước đang phát triển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ
10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả[12]. Các mẫu thuốc giả chủ yếu là
những thuốc được sử dụng khá phổ biến, được bệnh nhân sử dụng thường xuyên
thuốc như thuốc điều chỉnh huyết áp, thuốc giảm đường huyết, giảm cholesterol,
thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc
giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên công tác kiểm tra ngày càng khó


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 . GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN
1.1.1. Cấu tạo của atorvastatin
Atorvastatin có tên khoa học theo IUPAC: (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5axit
dihydroxyheptanoic và được biết đến với tên thương mại là Lipitor hay Atorva [1].
Công thức cấu tạo của atorvastatin là

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Atorvastatin.
Công thức phân tử là C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64 (g/mol)
Ngoài hoạt chất hay sử dụng trong các thuốc là atorvastatin còn có hoạt
chất atorvastatin canxi có công thức cấu tạo như hình 1.2.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin canxi
Atorvastatin canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, dR)-2-(rfluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1hepatanoicacid(1:2)trihydrate. Công thức phân tử là C18H68CaF2N4O10.3H2O hay
(C33H34FN2O5)2Ca.3H2O[1].

3


Atrovastatin canxi có khối lượng mol là1155,34 g/mol[1]
Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất
ít tan trong nước: 20,4 µg/mL (pH = 2,1); 1,23 mg/mL (pH = 6,0), tan ít trong
etanol, tan tốt trong methanol [1].
1.1.2. Dƣợc lực học và động học của Atorvastatin
Dược lực học
Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử 3-hydroxy-3methylglutaryl-coemzym A (HMG-CoA), ức chế quá trình chuyển hóa HMG-CoA
thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol. Do vậy atovasttin
có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol và triglicelid trong máu.

Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế
sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây xơ vữa động mạch và
còn làm giảm triglycerid máu. Do đó, cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong
huyết tương.
Dược động học
Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày ruột sau khi uống. Trong một
nghiên cứu ở người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 80% liều duy nhất fenofibrat
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ xuất hiện trong nước tiểu chủ yếu dưới dạng acid
fenofibric và các phức hợp glucuronide và 25% bài tiết trong phân. Nồng độ đỉnh
trong huyết tương của acid fenofibric xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống.
Không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng trong huyết tương.

1.3.

CÁC

PHƢƠNG

PHÁP

XÁC

ĐỊNH

ATORVASTATIN,

FENOFIBRAT
Atovastatin, fenofibrat có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau
như phương pháp quang học, phương pháp sắc ký, phương pháp von-ampe.


khoảng quét thế - 0,9 V ÷ -1,5V, bước thế 8 mV, thời gian xung 40 ms, tốc độ quét
thế 5,714 mV/s, giới hạn phát hiện (LOD)là 0,024μg.ml-1 và giới hạn định lượng
(LOQ) là 0,071 μg.ml-1, hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %.
Tác giả Wli Mohammadi [23] đã xác định đồng thời amlodipin và
atorvastatin canxi trên điện cực graphit được biến tính bề mặt bằng nano cacbon. So

6


với điện cực glassy cabon thì điện cực graphit có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt
hơn nên có độ nhạy tốt hơn. Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác
định được khoảng tuyến tính là 2,5 đến 100 µg/ml với độ lệch chuẩn của amlodipin
là 2,7 đến 7,1% và đối với atorvastatin canxi là 1,8 đến 8,3%, giới hạn phát hiện đối
với 2 chất là 1 µg/ml ở điều kiện pH=6.
Các điện cực glassy các bon và điện cực graphene oxit đã được sử dụng để
xác định atorvastatin trong môi trường pH từ 2,0 đến 4,5 bằng phương pháp vonampe hòa tan hấp phụ. Hơn nữa, điện cực rắn biến tính rất có triển vọng trong ứng
dụng phân tích dược và môi trường vì điện cực rắn có khoảng làm việc rộng, không
độc hại, thân thiện với môi trường, có thể tự chế tạo được.
1.3.2. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Tác giả [29] đã nghiên cứu xác định fenofibrat bằng phương pháp đo quang
trong mẫu dược phẩm sử dụng hai thuốc thử khác nhau. Với thuốc thử methylen
xanh (MTB) thì fenofibrat phản ứng với MTB trong dung môi cloroform và dùng
dịch đệm axit phthalat pH = 2,4 tạo ra phức chất màu xanh, có cực đại hấp thụ là
630nm, khoảng tuyến tính tuân theo Định luật Beer là 5 đến 15 mg/ml với độ lệch
chuẩn của phương pháp là 0,86%. Ở phương pháp thứ hai, cũng tiến hành như
phương pháp đầu nhưng dựa trên phản ứng của fenofibrat với saffarin tạo thành
phức màu hồng và độ hấp thụ quang đo được ở 520nm, khoảng tuyến tính thu được:
10 – 30µg/ml và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,903%. Đo trên mẫu dược
phẩm 200mg thì đạt hiệu suất thu hồi ở 2 phương pháp lần lượt tương ứng là

phòng, detector PDA, khoảng tuyến tính của fenofibrat là 32-160µg/ml với hệ số
tương quan là 0,994. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 1,9544µg/ml và
3,6225µg/ml tương ứng. Độ lệch chuẩn của phương pháp nhỏ hơn 2% [27].
Phương pháp cực phổ và von-ampe hòa tan
Tác giả Ceren Yardimci xác định fenofibrat trong mẫu thuốc bằng phương
pháp von-ampe hòa tan sóng vuông trên điện cực giọt thủy ngân treo (HDME) với
các điều kiện: Dung dịch đệm borat pH = 9,0 có chứa tetrabutylammoni iodua (
C16H36IN) 0,01M và 12,5%(v/v) metanol, thời gian sục khí N2 để loại oxi là 10
phút, khoảng đo thế từ -0,6V đến -1,4V, tốc độ quét thế 250mV/s, tần số sóng
15Hz, biên độ xung 20mV, bước thế 4mV, thế đỉnh píc E=-1,2V, khoảng tuyến tính
là 0,146-4,96µg/ml, giới hạn phát hiện là 0,025µg/ml. Tác giả đã ứng dụng phương
pháp để xác định mẫu thuốc có hàm lượng fenofibrat 250mg thu được hiệu suất thu
hồi là 102,44% [28]. Hiện nay, phương pháp cực phổ sử dụng hệ xúc tác là một
hướng quan trọng của ngành phân tích điện hóa. Đặc biệt là hệ xúc tác hydro áp
dụng cả với chất hữu cơ làm tăng độ nhạy phân tích và giúp nghiên cứu quá trình
điện cực và động học phản ứng hóa học.

8


Một nghiên cứu đã sử dụng phương pháp cực phổ dùng xúc tác hydro để
xác định fenofibrat. Fenofibrate và muối axit fenofibric dạng thủy phân của nó chứa
nhóm cacbonyl, nhóm này nhường 2e/2H+ trong quá trình điện phân thành 2 pic
tương ứng trong môi trường axit. Trong điều kiện thường, fenofibrat được thủy
phân hoàn toàn với muối axit fenofibric chỉ có 1 pic xuất hiện đã được xác định.
Khi có mặt K2S2O8 cường độ dòng pic xúc tác, giới hạn phát hiện của phương pháp
4.10-5mg/ml .
Qua tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định atorvastatin và
fenofibrat cho thấy, phương pháp von-ampe đã được nghiên cứu để xác định chúng
trong mẫu thuốc và mẫu sinh học, tuy nhiên các đặc tính điện hóa của chúng trên

Sau giai đoạn làm giàu là giai đoạn dừng để chất phân bố đều trên bề mặt điện
cực. Tiếp theo là giai đoạn hòa tan, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều
catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc, có
thể là phức chất của ion kim loại với phối tử tạo phức hoặc chất phân tích (chất hữu
cơ) và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von-ampe nào đó, chẳng
hạn: von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó phương pháp được
gọi là von-ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) hoặc von-ampe
sóng vuông (Square Wave - SW) khi đó phương pháp được gọi là von-ampe hòa tan
hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV). Ngược lại, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế
theo chiều anot, tức là quét thế dương dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện
cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng các kỹ thuật von-ampe.
Đối với phương pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu được có dạng đỉnh. Thế
đỉnh hòa tan (Ep) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như:
thành phần nền, phối tử ta ̣o phức , pH, thời gian tích lũy, thế tích lũy, bản chất của
điện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von-ampe hòa tan. Trong những điều kiện
xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dùng để
phân tích định tính. Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy
Ip dùng để phân tích định lượng.
Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể
xác định được bằng kĩ thuật cực phổ thông thường (hay quá trình xác định rất phức tạp)
như Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ. Cũng như von-ampe hoà tan thông
thường phương pháp von-ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phương pháp đo
von-ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ). Ngoài những ưu điểm trên,
phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng so với phương pháp SV như:

10


- Độ nhạy của AdSV thường lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà
tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử, ví dụ như điện cực màng

thay đổi từ 10-100mV và độ dài xung từ 40-100ms. Cường độ dòng được ghi hai lần,
lần 1 tại thời điểm i1, thường là 17ms trước khi nạp xung và lần hai là 17ms trước khi
cắt xung, lúc này ghi dòng cực phổ dưới tác dụng của xung. Hai giá trị này được gửi
vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Tín hiệu có dạng một
cực đại.
Kỹ thuật sóng vuông
Theo kỹ thuật này, điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều biến
thiên đều, được đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ 8 Hz
đến 2000 Hz, biên độ từ 1 đến 50mV. Trong mỗi chu kỳ xung, dòng được đo hai
lần: thời điểm 1 (dòng dương I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu được là hiệu
của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 – I2) và Ip là hàm của thế áp vào điện cực làm việc.
Đối với các chất có tính thuận nghịch thì kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy
cao hơn kỹ thuật xung vi phân.

12