BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM
LỚN
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


2

NGHỆ AN - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM
LỚN
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Vinh, tháng 10 năm 2014
Học viên

Phạm Thị Nguyệt


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC BẢNG.........................................................................................9
DANH MỤC HÌNH........................................................................................10
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
Bảng 1.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn..............................................13
Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất riêng như sau:.....................16
Bảng 1.2: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg
cân nặng/ngày)................................................................................................21
Bảng 1.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu.............................................21
Bảng 1.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang
(g/100g protein thô)[10, 35]............................................................................22
Bảng 1.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía
Nam Thỗ Nhĩ Kỳ (mg/100 g ± SD) [32].........................................................23
Bảng 1.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc
(g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [33]....................................24
Bảng 1.7: Thành phần axit amin không thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn
Quốc................................................................................................................24
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi........................40
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi các axit
amin.................................................................................................................44
Bảng 3.3: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/) của axit

Aminoquinolil- Nhydroxysuccinimidyl
carbamate
dry matter

EAA

Axit amin thiết yếu

Essential amino acid

FMOC

9-florenylmetyl cloroformat

9-florenylmethyl cloroformate

GC

Sắc ký khí
Sắc ký khí detector ion hóa
ngọn lửa

Gas chromatography
Gas chromatography/ flame
ionization detector
Gas chromatography/ mass
spectrometry
High performance liquid
chromatography


Sắc ký lỏng hiệu năng cao
pha ngược

TAA

Tổng axit amin

Nonessential amino acid
ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyde
Phenylisothiocyanate
Reversed phase - High
performance liquid
chromatography
Total amino acid

TEA

Trietylamin

Triethylamine

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

OPA
PITC


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series............................30
Hình 2.1: Mẫu nấm 03 Hình 2.2: Mẫu nấm 04 Hình 2.3: Mẫu nấm 05..........35
Hình 2.4: Mẫu nấm lỗ Hình 2.5: Mẫu nấm 01 Hình 2.6: Mẫu nấm 02...........35
Hình 2.7: Mẫu nấm 608 Hình 2.8: Mẫu nấm 619 Hình 2.9: Mẫu nấm 621....36
Hình 2.10: Mẫu nấm HKG 401 Hình 2.11: Mẫu nấm HKG 406....................36
Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân.......................................37
Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do..............................................38
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl.....41
Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại
nồng độ HCl 5M..............................................................................................42
Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại
nồng độ HCl 5,5M...........................................................................................42
Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại
nồng độ HCl 6M..............................................................................................43
Hình 3.5: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại
nồng độ HCl 6,5M...........................................................................................43
Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào thời gian thủy
phân.................................................................................................................45
Hình 3.7: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân
16h...................................................................................................................46
Hình 3.8: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân
18h...................................................................................................................46
Hình 3.9 : Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân
20h...................................................................................................................47
Hình 3.10: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân
24h...................................................................................................................47
Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Asp.......................................................49
Hình 3.28: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10 pmol/..............53


giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương
sống đã được mô tả, trong đó có những loài đặc hữu. Cấu trúc địa chất độc
đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự
đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.
Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là
nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng (Termitomyces albuminosus,
Macrocybe gegantea), là nguồn thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng, chứa
nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E...). Nhiều loài nấm
được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu để điều
chế các hoạt chất điều trị bệnh như: Laricifomes officinalis là nguyên liệu để
chiết aragicin dùng trong chữa bệnh lao hoặc dùng làm thuốc nhuận tràng hay
chất thay thế cho quinin. Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) được
dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,
AIDS. Trong quả thể của Ganoderma lucidum có các hoạt chất khác có hoạt
tính kháng virus. Chúng có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của
virus HIV. Các hoạt chất từ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u
cao, chúng được sử dụng trong điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung
thư dạ dày. Các dẫn xuất adenosine có trong Ganoderma capense và G.
amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu.
Nhiều hoạt chất từ linh chi có khả năng đào thải phóng xạ, hạn chế và loại trừ
những tổn thương do phóng xạ ở mô và tế bào.
Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các
protein thực vật (Belitz & Grosch, 1999) [15]. Axit amin cung cấp cho cơ thể
từ thực phẩm giàu protein. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành 20


2
axit amin, trong đó có 8 axit amin thiết yếu (bắt buộc phải được cung cấp từ
thức ăn, thức uống). Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức
năng đa dạng của cơ thể sống, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong

bao gồm nấm lớn và tất cả các nấm khác (như nấm men, nấm mốc, ...là các
vi nấm), được tách riêng do có các đặc điểm không giống cả động vật lẫn
thực vật.
Nấm theo nghĩa hẹp là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà nó có thể
mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắt thường và
được thu hái bằng tay.
1.1.2. Phân loại nấm
Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả
được 69000 loài bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn. Nấm là
các sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao
bọc bên ngoài thường chứa chitin polysaccharit, chất béo và protein. Nấm
không có chất diệp lục và do đó không thể thực hiện quá trình quang hợp. Do
đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau. Nấm sinh sản
hữu tính hoặc vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúc
phân nhánh gọi là sợi nấm.
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm
1.1.3.1. Chất khô, giá trị năng lượng
Hàm lượng chất khô trong nấm tươi là rất thấp, thường trong khoảng
60-140g/kg và chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và khoáng
chất. Thông thường, hàm lượng chất khô 100 g/kg đã được sử dụng để tính


4
toán nếu giá trị thực tế là không rõ. Hàm lượng nước cao và như vậy có ảnh
hưởng đến kết cấu và tham gia vào tuổi thọ ngắn của quả thể.
Hàm lượng lipid và chất khô thấp dẫn đến giá trị năng lượng thấp của
nấm. Các giá trị 86,4; 165; 126; 101 và 112 kJ/100g nấm tươi đã được báo
cáo cho các loài A. bisporus, Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus,
Sarcodon imbricatus và T. portentosum [12]. Các giá trị 118; 87,3; 131 và
159 kJ đã được tìm thấy cho các loài Cantharellus cibarius, L. nuda,

tươi gây ra sự giảm đáng kể.
Theo FAO/WHO, nấm được coi là giàu axit glutamic, axit aspartic và
arginine, tuy nhiên, các protein của chúng là thiếu methionine và cysteine. Các
axit amin hạn chế là leucine và lysine có trong L. edodes và P. ostreatus (nấm
sò tím) và P. eryngii (nấm sò vua). Điều thú vị là hai loại axit amin không phổ
biến: axit γ -amino butyric và ornithine đã được phát hiện, hai chất này thể
hiện các chức năng sinh lí quan trọng [41].
Hàm lượng của axit amin tự do trong nấm là thấp, chỉ khoảng 1% dm.
Vì thế, sự đóng góp thành phần dinh dưỡng của chúng là bị hạn chế. Tuy
nhiên, chúng tham gia vào hương vị của nấm. Axit glutamic và alanin được
báo cáo là axit amin tự do phổ biến trong T. portentosum and T. terreum [23].
1.1.3.3. Lipid (chất béo)
Nấm ăn cung cấp một lượng chất béo thấp. Các axit béo không bão hòa
chiếm ưu thế hơn các axit béo bão hòa đặc biệt là axit panmitic, axit oleic và
axit linoleic, trong khi đó các axit béo còn lại chỉ được tìm thấy với lượng nhỏ,
ngoại trừ trường hợp loài Lactarius deliciosus nó có chứa một lượng lớn của
axit stearic. Axit linolenic là tiền thân cho 1-octen-3-ol (còn gọi là nấm rượu),
là hợp chất thơm chủ yếu có trong hầu hết các loại nấm, nó là thành phần đặc
trưng và đặc sắc góp phần vào hương vị nấm [25].
Hàm lượng lipid tổng (chất béo thô) dao động chủ yếu từ 2% đến 6%
hàm lượng chất khô. Trong thành phần axit béo, axit linoleic không bão hòa đa


6
(C18:2), axit oleic không bão hòa đơn (C18:1) và axit palmitic bão hòa
(C16:0) là phổ biến. Tỷ lệ dinh dưỡng của axit bão hòa stearic (C18:0), và đặc
biệt là axit α -linolenic mong muốn (C18:2) thì thấp. Hàm lượng các axit béo
khác chỉ ở mức độ thấp. Hàm lượng của axit chuỗi nhánh và các axit béo
hydroxyl là không đáng kể [50].
Giá trị dinh dưỡng của chất béo trong nấm hoang là hạn chế vì hàm

quá trình chế biến công nghiệp của loài Boletus ở mức 21-57% và 8-74%.
1.1.3.6. Thành phần khoáng chất
Nấm là một nguồn tốt của các nguyên tố khoáng. Nguyên tố khoáng có
hàm lượng cao nhất là kali, tiếp theo là photpho, natri, canxi và magie. Chúng
được coi là thành phần nguyên tố khoáng chính; đồng, kẽm, sắt, mangan,
cadimi là những nguyên tố khoáng phụ.
Tính toán nồng độ thành phần của K, P, Na, Ca và Mg chiếm khoảng
56-70% tổng hàm lượng tro [35]. K là phong phú và chiếm khoảng gần 45%
tổng hàm lượng tro. Hàm lượng tro trong nấm thường chiếm từ 5-12% trọng
lượng khô. Nhìn chung, hàm lượng tro của nấm có phần cao hơn hoặc tương
đương với hầu hết các loại rau. Nấm chứa hàm lượng cao của photpho, kali và
tương đối cao của magiê. Tuy nhiên, một số nguyên tố còn lại sẵn có trong
nấm vẫn chưa được biết hàm lượng.
Điểm lưu ý đặc biệt là sự tích tụ trong nấm vết kim loại nặng, đặc biệt là
các nguyên tố độc hại như cadimi, chì và thủy ngân, thường có mặt trong các
chất nền nuôi cấy. Thật vậy, loài L. edodes được chứng minh là tích trữ một
lượng cadimi hiệu quả, trong khi loài A. bisporus, P. ostreatus, L. edodes và
một số loài thuộc chi Boletus tự nhiên giàu selen [26].
1.1.3.7. Thành phần hương vị
Hương vị đặc trưng của nấm được đánh giá cao bởi nhiều người tiêu
dùng. Hàng trăm hợp chất có mùi đã được xác định. Theo cấu trúc hóa học của


8
các hợp chất này thì chúng có thể được phân loại là chất dẫn xuất của octan và
octen, tecpen, dẫn xuất của benzandehit, hợp chất của lưu huỳnh và những
chất khác [29].
Hương vị đặc trưng của nấm hoang có thể được phân thành: thành
phần không bay hơi (vị) và các thành phần dễ bay hơi (mùi). Các hợp chất dễ
bay hơi khác nhau như tecpen, các dẫn xuất của octan, 1- octen và 2 -octen,

cũng đã công bố rằng loài nấm Calvatia gigantean được thu hoạch để sử dụng
như chất cầm máu cho bất kì vết thương nào, đặc biệt là dùng cầm máu cho
rốn trẻ sơ sinh. Sự quan tâm của các nhà khoa học trên loài nấm là đang được
phát triển vì chúng là nguồn chính của dược phẩm mới tiềm năng và bổ sung
vào chế độ ăn uống [52].
Nhiều chất kháng sinh quan trọng được chiết rút từ nấm. Chẳng hạn
như penicilin được phát hiện và sau đó được phát triển như chất điều trị y tế
chống nhiễm khuẩn. Penicillin có lẽ là nổi tiếng nhất của tất cả các loại thuốc
kháng sinh, có nguồn gốc từ một loại nấm thông thường gọi
là Penicillium. Nhiều loại nấm khác cũng sản xuất các chất kháng sinh, mà
hiện nay được sử dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh trong người và động
vật. Việc phát hiện ra kháng sinh là một cuộc cách mạng chăm sóc sức khỏe
trên toàn thế giới.
Nhiều đặc tính có lợi của nấm dùng phòng ngừa và điều trị một số bệnh
đã được mô tả bao gồm: chống oxi hóa, kháng u, điều hoà miễn dịch, kháng
virut, kháng khuẩn, ký sinh trùng và hiệu quả trong trị đái tháo đường; nấm
còn có tác dụng ngăn ngừa các bệnh như cao huyết áp, tăng cholesterol máu,
xơ vữa động mạch và ung thư do các thành phần hóa học cụ thể của nấm và
các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau. Sản phẩm chữa bệnh quan trọng
có thể được phân lập từ nấm ăn được và nấm không ăn được. Ngày nay
khoảng 7000 loài nấm là ăn được ở mức độ khác nhau. Ngoài ra, 2000 loài đã
được đề xuất có đặc tính chữa bệnh [43].


10
Ví dụ, hiện nay sự quan tâm lớn đó là β-glucan trong nấm vì những ảnh
hưởng tích cực của nó đến sức khỏe [51]. β-glucan trong nấm được coi là hợp
chất chức năng bởi vì chúng xuất hiện để điều chỉnh miễn dịch dịch thể và tế
bào, và có tác dụng có lợi trong việc đấu tranh chống lại nhiễm trùng, bên
cạnh đó nó cũng làm giảm cholesterol trong máu. Gần đây, chất này đã được

Thường được nhóm với các loại rau, nấm cung cấp nhiều thuộc tính
dinh dưỡng, cũng như các thuộc tính thường được tìm thấy trong thịt, đậu
hoặc các loại ngũ cốc. Nấm là ít calo, không có chất béo, cholesterol và natri
rất thấp, nhưng chúng cung cấp một số chất dinh dưỡng mà thường được tìm
thấy trong các loại thực phẩm động vật hoặc các loại ngũ cốc [57]. Giống như
tất cả các loại trái cây và rau quả, nấm tự nhiên không có gluten, nên bổ
dưỡng với một chế độ ăn không có gluten. Nấm có đủ các chất hữu cơ cần cho
nhu cầu dinh dưỡng của người như protein, gluxit, lipit, vitamin, muối khoáng
và nhiều loại enzim rất lợi cho tiêu hoá và có giá trị dinh dưỡng cao.
Nấm ăn Việt Nam có hơn 200 loài trong đó khoảng 50 loài là nấm ăn
quý. Tuyệt đại đa số nấm ăn Việt Nam thuộc các đại diện của nấm Đảm
Basidiomycota và một số ít thuộc nấm túi Ascomycota. Có thể kể một số ví dụ
như: mộc nhĩ, nấm hương, nấm rơm, ngân nhĩ, nấm thông, nấm chàm, nấm
bào ngư, nấm kim châm, nấm ngọc châm…(Trịnh Tam Kiệt, 2011).
Ngoài ra, các loài nấm có khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học và
bảo vệ môi trường
Những loài nấm có khả năng sinh enzim và một số hoạt chất quý có thể
được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.
Nấm là bộ phận quan trọng trong công nghệ lên men. Các loài nấm men
như saccaromyces được dùng để oxi hóa đường thành etanol và khí cacbonic.
Quá trình này gọi là sự lên men rượu. Và ứng dụng trong làm rượu vang, bia
và bánh mỳ, phomat và một số các sản phẩm đậu nành…
Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần
hoàn vật chất và năng lượng trong thiên nhiên. Nấm hoại sinh sử dụng hệ men


12
của chúng để phân giải các chất hữu cơ, các cành lá khô của thực vật thành
chất mùn, chất khoáng. Nấm có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành
các chất đơn giản, đặc biệt là các chất khó phân giải như cellulose, lignin

H

O
C

H
O

Dạng phân tử

H

+

_
O

R

N

Cα

H

H

C
O


L-Glutamin

L-Glycin

Axit L-Glutamic

L-isoleucin

L-Leucin

L-Lysin

L-Methionin

L-Phenylalanin

L-Prolin

L-Serin

L-Thrionin

L-Tryptophan

L-Tyrosin

L-Valin


14