1

ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) là loại u não
nguyên phát của hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% các u nội
sọ [1]. Tổ chức Y tế Thế giới phân loại U nguyên bào thần kinh đệm là loại
ác tính nhất (độ IV) [2]. Tỉ lệ U nguyên bào thần kinh đệm ở nam cao hơn
nữ giới, tuổi phát hiện trung bình khoảng 64 tuổi [3].
U nguyên bào thần kinh đệm là loại u rất ác tính, thường hình thành
trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước
khi xuất hiện triệu chứng. Biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng
tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời
gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 10-12 tháng [4].
Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình sinh
bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính xác và
hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết. Các nhà khoa
học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen như RTEL1,TP53,
RB1,NF1, PIK3R1, ERBB2, EGFR,IDHl [5-8]… trong đó gen RTEL1 được
phân loại như một gen ức chế khối u, khi gen bị đột biến, tế bào bị tổn
thương, DNA sẽ không được sửa chữa và kiểm soát dẫn đến hình thành và
phát triển thành khối u [9-12] .
Gen RTEL1 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 20, dài 40,889kb, gồm
40 exon. Các đột biến hay gặp của gen trên u nguyên bào thần kinh đệm là
các đột biến điểm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số đa hình
gen như SNPrs6010620, SNPrs2297440 trên intron 12 của gen RTEL1 có
liên quan mật thiết tới nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [9-14].
Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về xác định một số đa hình trên gen


2


trên thế giới có khoảng 21.000 trường hợp tử vong do ung thư [15,16]. Ước
tính đến năm 2050 thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu ca ung thư mới mỗi
năm với khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong. Có một thực tế rằng tỷ lệ mắc
ung thư đang chậm lại ở các nước phát triển, nhưng lại tăng cao tại các nước
đang phát triển trong đó có Việt Nam. Rõ ràng chúng ta cần phải có những
biện pháp kịp thời để ngăn ngừa sự hình thành và tiến triển cũng như nâng cao
hiệu quả trong việc điều trị ung thư [17].


4

Từ những nghiên cứu đột phá trong Y học, cơ chế phân tử của ung thư
dần được sáng tỏ. Theo đó, chính sự tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn
tới sự phát sinh, phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình
chuyển dạng tế bào sang ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các
gen gây ung thư và đột biến gây bất hoạt các gen áp chế ung thư nằm tại một
số vị trí chủ chốt trên các con đường tín hiệu tế bào [18,19]. Cơ chế điều hòa
gen vốn hoạt động nhịp nhàng và chặt chẽ cũng bị rối loạn khiến hệ thống các
enzym sửa chữa thương tổn gen của tế bào không thể khắc phục dẫn tới việc
tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát quá trình ung thư [20,21].
Nhưng cũng chính các đột biến lại làm tăng ái lực của thuốc điều trị đích với
các phân tử này và ức chế sự dẫn truyền tín hiệu trong các tế bào ung thư.
Nhờ đó chúng làm tăng hiệu quả của thuốc điều trị đích trong việc tiêu diệt
các tế bào ung thư [22]. Chính vì vậy việc nâng cao hiệu quả điều trị, theo dõi
tiên lượng bệnh trong ung thư hiện nay luôn cần có các xét nghiệm phân tích
đột biến gen tương ứng với mỗi loại hình ung thư.
U nguyên bào thần kinh đệm (GB) là một trong các khối u não phổ biến
nhất hiện nay [23,24]. Bệnh nhân mắc loại ung thư này thường có tiên lượng
không tốt do sự tiến triển nhanh chóng và xâm lấn các tổ chức mô não, thần
kinh của khối u trong hộp sọ [25]. Tuy nhiên với những hiểu biết về cơ chế

Các tế bào của u nguyên bào thần kinh đệm có nguồn gốc phôi thai
giảm biệt hoá tăng sản được chia thành 2 loại dựa vào nguồn gốc phát sinh là
u phôi thai tiên phát (60%) và u thứ phát từ tế bào hình sao [34].
Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá điển hình với
ranh giới hình vòng cung không rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu xám hay
hồng, có điểm hoại tử màu vàng hoặc ở vùng có xuất huyết thì màu đỏ hoặc
nâu thâm. Thành mạch máu trong u tăng sinh dày, có thể gặp u thể nang hay


6

nhiều ô, u thường có mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dánh vào màng
não gây chảy máu [35,36].
Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất khác nhau.
Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với nhiều
giai đoạn trung gian giữa hai loại tế bào. Tính biệt hoá thấp, tạo sự giảm thiểu
các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái [35,36]. Có 3 thể u
chủ yếu sau:
- U nguyên bào thần kinh đệm đa hình: gồm chủ yếu những nguyên bào
thần kinh đa hình xem kẽ một số neuron của vỏ não. Các tế bào này ít biệt hoá,
nhân bắt màu đậm, thô, nhiều nhân chia co cụm cung quanh một số điểm hoại tử
nhỏ. Mao mạch u thành dày, tăng sản mạnh tế bào nội mô, nhiều điểm xuất
huyết rải rác có chỗ lòng mạch bị chít hẹp và tổ chức hoá hay vôi hoá [36].

Hình 1.1. Tiêu bản nhuộm HE mô u nguyên bào thần kinh đệm
U nguyên bào thần kinh đệm
Độ phóng đại x400 lần; trên tiêu bản cho thấy mật độ u dày đặc, đa hình
dạng, có dị nhân, nhân quái, nhân chia. Tế bào biệt hoá theo hướng khác
nhau, hoại tử hình bản đồ, tăng sinh mội mạch dạng cuộn. Kết quả được thực
hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức.

1.4. Chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm
1.4.1.Triệu chứng lâm sàng và những dấu hiệu thường gặp
Trong giai đoạn sớm, bệnh nhân không có các triệu chứng điển hình và
thường dễ dàng bị bỏ qua [32].
Trong giai đoạn bệnh tiến triển, bệnh nhân xuất hiện các triệu chứng
của tăng áp lực nội sọ do sự phát triển của khối u. Các triệu chứng bao gồm
những cơn đau đầu dữ dội vào các buổi sáng và giảm hơn trong ngày. Các
hoạt động làm gia tăng áp lực nội sọ như ho, hắt hơi, cúi xuống hoặc làm
các công việc nặng đều làm gia tăng mức độ của các cơn đau. Tăng áp lực
nội sọ khiến bệnh nhân có thể bị rối loạn tầm nhìn và rối loạn khả năng
thăng bằng [33,34].
Ngoài ra, bệnh nhân còn có thể xuất hiện một số triệu chứng liên quan
đến vị trí của khối u như: thay đổi về tính cách và trí tuệ, khó khăn trong việc
diễn đạt ngôn ngữ, khó khăn trong việc thực hiện các di chuyển phối hợp, liệt
hoặc suy yếu nửa người…[31,32]
Soi đáy mắt bệnh nhân có thể có phù gai thị, một dấu hiệu của tăng áp
lực nội sọ.
1.4.2. Các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh
Chụp cắt lớp vi tính não (CT-Scanner): có thể chụp thông thường hoặc
sử dụng thuốc cản quang để tăng cường hình ảnh tại một số vùng nhất định
của não. Phương pháp này cho phép xác định chính xác vị trí và kích thước
của khối u [38, 44, 45].
Chụp cộng hưởng từ (MRI): được áp dụng khi cần xác định chi tiết vị
trí khối u. MRI cho biết tỷ trọng, mật độ, cấu trúc và có thể phát hiện được
những thay đổi rất nhỏ bên trong và các vùng lân cận của khối u [38, 44, 45].


9

Chụp positron cắt lớp (chụp PET-CT): phương pháp này cung cấp hình

giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc
lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu.
Điều trị tia xạ
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại
sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn
không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma
tuyến yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị
các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của
trang thiết bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não,
phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao.
Điều trị hoá chất
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta
khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển
nhanh, cụ thể đối với các loại U nguyên bào thần kinh đệm, Astrocytoma độ
III và độ IV. Nhiều tác giả đã cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị
tốt hơn.
Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau:
Cyclophosphamide (Endoxan), 5 Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate (Aethopterin),
Vincristine (Oncovin), Mythramycine (Mithrancin), Doxorabicine (Adriamycine).
Hoá chất dùng sau tia phóng xạ, cả hai phương pháp này dùng điều
trị bổ sung sau phẫu thuật.


11

Điều trị corticoid và điều trị bằng miễn dịch cũng được đề cập đến
trong u não. Mục đích của điều trị corticoid là ngăn ngừa tình trạng phù não

đệm). Các u nguyên bào mạch trong não và trong ống sống thường xuất hiện
với bệnh Von Hippel Lindau.
Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy cơ mắc các u lymphô ở não.
Khoảng 20% bệnh nhân có biểu hiện suy giảm miễn dịch kéo dài và từ 5%
đến 8% bệnh nhân AIDS bị u lymphô ác tính, thường là lympho B.
1.5.2.Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế phân tử và vai trò của đột biến gen trong u nguyên bào thần
kinh đệm:
Nghiên cứu đầu tiên về tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh
đệm được công bố khoảng 35 năm trước đây. Trong nhiều năm sau đó, những
gen đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát
triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố
phát triển biểu mô (epidermal growth factor receptor, EGFR), gen áp chế ung
thư TP53 đã được nghiên cứu [41,42]. Bên cạnh đó một số gen đánh giá mức
độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm soát sự phân chia của tế bào ung thư như
RTEL1 và Hes3 cũng được xem xét và đánh giá trong u nguyên bào thần kinh
đệm. Dựa trên tình trạng đột biến gen, các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng
có một cái nhìn tổng thể về nguy cơ, mức độ tiến triển để có biện pháp can
thiệp điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị cũng như theo dõi tiên lượng
đối với bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [46].
Cơ chế của gen RTEL1:
RTEL-1 (regulator of telomere length-1) là DNA helicase quan trọng
giúp ổn định cấu trúc bậc hai của DNA và duy trì sự nguyên vẹn của
telomere. RTEL-1 điều khiển quá trình tái tổ hợp nhiễm sắc thể trong nguyên


13

phân và giảm phân. Trong những năm qua, các nhà khoa học đã đưa ra bằng
chứng chứng minh các đột biến điểm trên gen RTEL-1 làm tăng nguy cơ mắc

NCBI tính đến ngày 16/10/2014 bộ gen người có 112,736,879SNP. Tính trung
bình, cứ khoảng 3000 bp thì lại xuất hiện một SNP. Những biến thể này được
xem như là các đánh dấu sinh học, giúp xác định vị trí các gen liên quan đến
bệnh. Khi các SNP xảy ra trong gen hoặc trong một khu vực gần một gen quy
định, nó có thể có vai trò trực tiếp đến sự xuất hiện bệnh bằng cách ảnh hưởng
đến chức năng của gen.

Hình 1.2. Hình ảnhminh họa hiện tượng đa hình thái đơn nucleotid SNP
(Nguồn: )
Sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có liên quan đến những khác
biệt trong sự phát triển bệnh, đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất,
thuốc, vaccine và các tác nhân khác. Trong nghiên cứu y sinh học, các nhà
nghiên cứu tiến hành so sánh trình tự gen của các nhóm người khác nhau
(giữa nhóm người bị bệnh và không bị bệnh...) để từ đó xác định mối liên
quan giữa các SNP với khả năng mắc bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ cũng
như phương pháp chữa trị.


15

1.6.2. Gen RTEL1
Gen RTEL1 được phân loại như một gen ức chế ung thư,nằm trên cánh
dài nhiễm sắc thể 20, ở vị trí 13.3 từ cặp base 63.657.809 đến cặp base
63.696.252 dài 40,889kb,gồm 40exon.
Một số nghiên cứu cho thấy kiểu gen GG của SNPrs6010620 thường
hay gặp ởbệnh nhân bị u nguyên bào thần kinh đệm, trong khi đó kiểu gen AG
và AA thường hay gặp ở nhóm người bình thường, vì vậy người có kiểu gen
GG tại vị trí SNPrs6010620 được xem như là người có nguy cơ cao bị bệnh
[12,13,15].
Tương tự như vậy, kiểu gen CC của SNPrs2297440 thường hay gặp ở

1.7. Các phương pháp xác định kiểu gen RTEL1
1.7.1. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Nguyên tắc chung: dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả
năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn
loại nucleotid. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi
ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.Phản ứng PCR
là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:
1. Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 oC
- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
2. Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ
thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút.
3. Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt
(Taqpolymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt


17

nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được
dùng làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản
phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA mạch kép có chiều dài là
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [33], [34], [35].

Bước 1: biếntính


tỷbảnsao


18

Số lượng sản phẩm DNA tạo thành khi hoàn thành phản ứng PCR được
biểu thị bằng công thức sau:
N = 2n
N: số lượng bản copy sản phẩm tạo thành
n là số chu kỳ của phản ứng.
1.7.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các
nucleotid trong phân tử DNA. Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như
trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với
nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các
deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp.Sự gắn của
các dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được
tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.
Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy
đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại
dideoxynucleotid(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn
hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát
huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.


19

Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP
Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách


21

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nhóm chứng: 80 đối tượng
Tiêu chuẩn lựa chọn: người khoẻ mạnh, không có bất kỳ một khối u hay
ung thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các bệnh lý
về phổi.
Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm
Tiêu chuẩn lựa chọn: 80 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng mô
bệnh học tại Bệnh viện Việt Đức là u nguyên bào thần kinh đệm.
Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan
nào khác.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu
•
•
•
•
•
•
•
•

Máy PCR (Eppendorf)
Máy điện di: Mupid (Nhật Bản).
Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin Chemi Wealtec, USA).
Máy quang phổ kế Nano- Drop (Nhật Bản).

Dung dịch SDS10%.
Proteinase K (10mg/l).
Dung dịch phenol:chloroform:isoamyl có tỷ lệ 25:24:1.
Dung dịch chloroform:isoamyl có tỷ lệ 24:1.
Sodium acetate 3M, pH 5,2.
Ethanol tuyệt đối và Ethanol 70%.
Dung dịch TE để hòa tan DNA và bảo quản DNA sau khi tách.
Kít tinh sạch DNA từ gel (Hãng QIAGEN-Đức).
Quy trình pha một số hóa chất:

Dung dịch Lysis buffer
Hóa chất

Nồng độ

Lượng hóa chất

Sucrose

0,3M

51.3gram

Trisbase HCl (pH=7,5)

0,01M

0.785gram

MgCl2


0,024M

1,7868gram

Thêm nước vừa đủ 200ml, chỉnh pH=8 bằng NaOH
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:
+
+
+
+

Taq DNA polymerase 1000U (Hãng QIAGEN-Đức).
Taq PCR Microsatellite kit (Hãng QIAGEN-Đức).
dNTP, PCR grade (Hãng QIAGEN-Đức, 250µl).
Sử dụng các cặp mồi được gắn với chất huỳnh quang đặc hiệu.

- Hóa chất chạy điện di:
+
+
+
+

Sample Loading Solution (SLS).
Size Standard 600.
Mineral Oil.
Buffer Plate, Sample Plate 96 wells.

- Hoá chất để giải trình tự gen:
+



25

Sơ đồ nghiên cứu

Bệnh nhân

Chứng

(n=80)

(n=80)

Tách chiết DNA từ
máu toàn phần

Phân tích
SNPr6010620,SNP229744
0TP53, MDM2

Kỹ thuật PCR

Giải trình tự
gen(SNPrs6010620,S
NPrs2297440)
Kết quả
Xác định đa hình
đơn SNPrs6010620,
SNPrs2297440

bệnh u nguyên bào
thần
thầnkinh
kinhđệmyếu
đệmyếu
tốtốnguy
cơ
nguy cơkhác.
khác.