ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN
Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH
BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội– Năm 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN
Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH
BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 01 21
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT......................................................................1
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................2
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................3
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................6
1.1

Lịch sử nghiên cứu ......................................................................................6

1.2

Bệnh u nguyên bào thần kinh ......................................................................6

1.2.1

Đặc điểm lâm sàng ..................................................................................6

1.2.2

Phân loại u NBTK ..................................................................................8

1.2.3

Phân loại giai đoạn u NBTK ...................................................................9

1.2.4

Một số yếu tố tiên lƣợng của u NBTK ..................................................10

2.2.1

Hóa chất ................................................................................................22

2.2.2

Trang thiết bị .........................................................................................22

2.3

Phƣơng pháp nghiên cứu...........................................................................22

2.3.1

Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xƣơng .........................................22

2.3.2

Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ .........................................................23

2.4

Đạo đức trong nghiên cứu .........................................................................24


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................26
3.1

Xác định khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u NBTK bằng kỹ thuật lai


Children’s Oncology Group

Tổ chức Ung thƣ Trẻ em

DAPI

4',6-diamidino-2-phenylindole

DMs

Double-Minute chromatin bodies Đoạn nhiễm sắc thể kép ngắn

FBS

Fetal Bovine Serum

Huyết thanh phôi bò

FISH

Fluorescent in-situ hybridization

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại
chỗ

HSR

Homogeneously

Staining Vùng bắt màu đồng nhất

nguyên bào thần kinh

MBH

Mô bệnh học

MKI

Mitosis karyorrhexis Index

NBTK

Chỉ số nhân chia/nhân tan
Nguyên bào thần kinh

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

SSC

Saline Sodium Citrate
1

Muối Natri Citrate

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

1


Hình 1.4. Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10] ......... 19
Hình 2.1. Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 ................................. 24
Hình 3.1. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u ........................................................... 26
Hình 3.2. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xƣơng ............................................. 27
Hình 3.3. Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs ...................................... 27
Hình 3.4. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK ............................... 29
Hình 3.5. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi .............................................. 31
Hình 3.6. Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi ................................... 32
Hình 3.7. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới ........................................................ 33
Hình 3.8. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới ........................................................ 33
Hình 3.9. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u .................... 34
Hình 3.10. Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u ....... 35
Hình 3.11. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH .................................. 36
Hình 3.12. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH .................................. 37

3


4

MỞ ĐẦU

Ung thƣ là một rối loạn về phát triển của các tế bào, ở đó các tế bào tăng sinh
không kìm hãm, kết quả là hình thành các khối u trong cơ thể. Khối u là một tập hợp
các tế bào có chung các đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các
cơ quan tổ chức xung quanh. Ung thƣ có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi,trong đó ung thƣ
nhi chiếm khoảng 2% tổng số các loại ung thƣ.
U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm , ở đó
tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chƣa biệt hóa xuất phát từ mô
mào thần kinh, chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dƣới 6 tuổi), hiếm khi tìm thấy

đại gen MYCN.

5


1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử nghiên cứu
U nguyên bào thần kinh (Neuroblastoma – u NBTK) đƣợc mô tả là bệnh ung thƣ
tiến triển. Các tế bào thần kinh chƣa trƣởng thành đƣợc tìm thấy trong bào thai hoặc
thai nhi, đƣợc gọi là các tế bào nguyên bào thần kinh (Neuroblast). Năm 1864, bác sĩ
ngƣời Đức tên là Rudoft Virchow phát hiện các khối u đƣợc tìm thấy trong ổ bụng của
trẻ em mắc bệnh u thần kinh đệm (glioma). Năm 1910, James Horner-Wright, một nhà
giải phẫu bệnh ở Boston (Hoa Kỳ), đã công bố một mô tả một loạt khối u thƣợng thận
ở trẻ em, có đặc điểm tế bào giống với các tế bào thần kinh nguyên thủy của tuyến tủy
thƣợng thận bào thai. Vì vậy, ông đã đặt tên hiện tƣợng này là “u nguyên bào thần
kinh”[31]. Các kiểu di căn của u NBTK cũng đƣợc mô tả với công bố của bác sĩ
William Pepper về các nốt di căn gan của trẻ u NBTK giai đoạn 4S và công bố của
bác sĩ Robert Hutchison về các ổ di căn tại mắt [31].
UNBTK ban đầu đƣợc phẫu thuật cắt bỏ và xạ trị tại Bệnh viện Nhi Boston từ
những năm 1940 [31]. Đồng thời, giá trị tiên lƣợng của tuổi chẩn đoán và di căn
xƣơng cũng đƣợc xác định. Hóa trị liệu bắt đầu đƣợc sử dụng vào năm 1951 bởi
Farber [17]và 1964 bởi Thurman[34] với một vài thành công bƣớc đầu.
1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh
U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm .Ở đó
tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chƣa biệt hóa xuất phát từ mô
mào thần kinh. Chính vì thế, u NBTK thƣờng xảy ra ở trẻ nhỏ[10].
Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dƣới 15 tuổi; là một

có thể di căn vào phổi, màng phổi[5].
1.2.2 Phân loại u NBTK
ChẩnđoánmôbệnhhọcuNBTKchủyếudựatrênhìnhtháihọc. Năm 2003, Hiệp hội
Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế (INPC, International
Neuroblastoma

Pathology

Committee)

đã

thống

nhất

đƣa

ra

HệthốngphânloaiuNBTKquốctếdựatrêncácbiếnđổihìnhtháiphốihợpvớiquátrìnhbiệthoá
cũngnhƣcácyếutốtiênlƣợngMBH,phânloạiuNBTKthành4nhómnhƣsau[31]
UNBTK(neuroblastoma)là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm dƣới
50% toàn bộ khối u. Dựa trên thành phần nguyên bào thần kinh, các u nguyên bào
thần kinh đƣợc chia thành chƣa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa:


U nguyên bào thần kinh chƣa biệt hóa (undifferentiatedneuroblastoma) chiếm
khoảng 2-3% tổng số u nguyên bào thần kinh.


1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK
Hệ thống phân loại u NBTK đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay là hệ thống INSS
(International Neuroblastoma Staging System), sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên,
ra đời năm 1988 bởi Brodeur và cộng sự (Bảng 1.1)[41].
Bảng 1.1. Các giai đoạn theo INSS
Giai đoạn

Lâm sàng

1

Khối u khu trú có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, có hoặc không có tồn
dƣ bệnh vi thể; biểu hiện qua không di căn hạch bạch huyết 1 bên cơ
thể ở mức độ vi thể.

2A

Khối u khu trú không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, biểu hiện qua
không có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể ở mức độ
vi thể.

2B

Khối u khu trú có hoặc không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn; có di
căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể. Hạch bạch huyết mở
rộng đối bên phải không có tế bào u di căn ở mức độ vi thể

3

Khối u 1 bên không thể cắt bỏ đã vƣợt qua đƣờng giữa cơ thể, có

nguy cơ về hình ảnh

M

Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS)

MS

Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da, gan
và/hoặc tủy xƣơng.

Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS còn phải xem xét đến 2 yếu tố là tuổi
chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) và khối u tiên phát lớn không thể cắt bỏ đƣợc. Bên
cạnh đó, nghiên cứu một số lƣợng lớn bệnh nhân đã cho thấy việc sử dụng 18 tháng
làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng hơn so với việc sử
dụng 12 tháng tuổi nhƣ trƣớc đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS
hay INRGSS tùy thuộc vào cơ sở vật chất và bác sĩ. INSS đƣợc lựa chọn ở những nơi
có cơ sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế. Do đó, việc xác
định giai đoạn sẽ dựa vào phẫu thuật và điều trị sẽ dựa theo phân loại đó. Còn ở những
nơi có cơ sở vật chất và tay nghề bác sĩ tốt hơn, các nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống
INRGSS. Vì khi đó, nhiều bệnh nhân không cần có sự can thiệp về y tế mà vẫn có thể
khỏi bệnh, đặc biệt là các khối u khu trú ở trẻ ít hơn 1 tuổi.
1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK
1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN
Nhiều biến đổi di truyền đã đƣợc xác định ở u NBTK có ý nghĩa tiên lƣợng
bệnh, dựa trên đó có thể xác định đƣợc các bệnh nhân có nguy cơ tái phát hoặc có xu
hƣớng tiến triển nặng. Trong đó việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên
lƣợng cao đƣợc sử dụng để phân nhóm nguy cơ [11].
10



hoặc 4S

hoặc 3

MYCN

gen MYCN

Không mất đoạn 1p
Giai đoạn 2
Tuổi < 2

Nguy cơ trung bình

Mất đoạn 1p

Giai đoạn 3
Tuổi 2

Nguy cơ cao

Nguy cơ thấp

Nguy cơ trung bình

25% [6, 11, 20].

Hình 1.2. Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34]
Nhóm bệnh nhân nguy cơ cao:

đoán có những tiên lƣợng khác nhau đã đƣợc thông qua với sự đồng thuận quốc tế là
18 tháng. Tuy nhiên với các bệnh nhân giai đoạn M và không có khuếch đại gen
MYCN, việc đánh giá tiên lƣợng về tuổi sẽ áp dụng điểm cắt về tuổi là 12 tháng [14].
Có 3 nhóm nguy cơ đƣợc xác định tỷ lệ sống sót trong vòng 5 năm dựa trên độ
tuổi, giai đoạn và trạng thái của gen MYCN nhƣ sau:
 Các bệnh nhân ở giai đoạn 1, 2, hay 4S ở tất cả các độ tuổi mà không có
khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó là 95% [23].
 Các bệnh nhân ở giai đoạn 3 cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh ở giai đoạn
4, không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó khoảng 75% [10].
 Các bệnh nhân lớn hơn 1 tuổi ở giai đoạn 4, ở giai đoạn 2 hay 3 mà có
12


khuếch đại MYCN cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh đã di căn, có khuếch đại
MYCN thì tỷ lệ đó chỉ là 30% [16].
U NBTK ở trẻ lớn (> 13 tuổi) và ngƣời lớn có một số đặc điểm cận lâm sàng,
lâm sàng, tiến triển và tiên lƣợng bệnh khác với u NBTK ở trẻ em [15].
1.2.4.3 Yếu tố mô bệnh học
Chỉ số MKI
MKI (mitotic – karyorrhectic index) là tỷ lệ giữa số lƣợng tế bào ở kỳ nguyên
phân và kỳ phân hủy nhân. Hình ảnh nguyên phân đặc trƣng bởi các khối đặc chất
nhiễm sắc hình tròn, có mấu nhọn và không có màng nhân. Tế bào phân hủy có hình
ảnh các khối đặc từng đoạn kèm theo bào tƣơng đặc bắt kiềm.
Chỉ số MKI đƣợc chia thành 3 loại (Bảng 1.3):
Bảng 1.3. Chỉ số MKI
Tỷ lệ phần trăm

Số lƣợng tế bào

MKI thấp


Bảng 1.4. Bảng phân loại mô bệnh học
Mô bệnh học

MKI

Tuổi chẩn đoán

Nhóm mô bệnh học thuận lợi
U NBTK ít biệt hóa

MKI trung bình

Ít hơn 1,5 tuổi

U NBTK ít biệt hóa

MKI thấp

Ít hơn 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa

MKI trung bình

Ít hơn 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa

MKI thấp

Mọi MKI

Mọi độ tuổi

U NBTK ít biệt hóa

MKI trung bình

Trên 1,5 tuổi

U NBTK ít biệt hóa

MKI thấp

Trên 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa

MKI cao

Mọi độ tuổi

U NBTK đang biệt hóa

MKI trung bình

Trên 1,5 tuổi

U NBTK đang biệt hóa


không vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Một số các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh có
biểu hiện mức độ cao với protein MYCN mà không có khuếch đại gen.Điều này có thể
do sự thay đổi trong chu trình suy thoái protein hơn là trong quá trình tự điều hòa dịch
mã gene MYCN.
Ở giai đoạn đầu, sự biểu hiện của protein MYCN có thể đƣợc tìm thấy ở tất cả
các giai đoạn của bệnh. Điều này đƣợc cho rằng sự biểu hiện của MYCN không liên
quan đến kiểu hình lâm sàng. Tuy nhiên, trong nhóm các khối u không có sự khuếch
đại genMYCN, một số nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện protein MYCN có liên quan
tới khả năng sống sót; trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại không thấy sự liên
quan nào. Trong tƣơng lai, với các nghiên cứu lớn hơn về việc điều trị bệnh nhân với
các phƣơng pháp tiêu chuẩn là cần thiết để tìm hiểu về mức độ biểu hiện protein
MYCN có liên quan đến tiên lƣợng tiến triển các khổi u khi thiếu sự khuếch đại
genMYCN[25]
Các nghiên cứu đầu tiên về u nguyên bào thần kinh cho thấy các tế bào u nguyên
bào thần kinh đều có các mảnh nhỏ chất nhiễm sắc kép (double-minute chromatin
bodies (DM)) cũng nhƣ các vùng bắt màu đồng nhất (homogeneously staining regions
(HSR)) trên các nhiễm sắc thể lớn. Về sau, những bất thƣờng nhiễm sắc thể này đều
đƣợc khẳng định là biểu hiện về mặt di truyền tế bào của một sự khuếch đại, gen
MYCN. Tuy nhiên, sự khuếch đại MYCN thƣờng đƣợc tìm thấy ở ngoài vị trí này:
hoặc trong vùng HSR của nhiễm sắc thể khác, hoặc trong DM ngoài nhiễm sắc thể,
hoặc cả hai.

15


Hình 1.3. Cơ chế khuếch đại gen[27]
Cơ chế khuếch đại MYCN đến nay vẫn chƣa đƣợc hiểu hết. Theo nghiên cứu của
Matsui A. và cộng sự (2013), đầu tiên DSB (Double - stranded break) xuất hiện ở
vùng đứt gẫy telomere trên nhiễm sắc thể. Để thay thế, sợi chromatid bị mất vùng
telomere đƣợc tái tạo. Hai đầu bị mất vùng telomere đƣợc ghép nối và tạo thành dạng

thể có giá trị tiên lƣợng, nhƣng phân tích nhiễm sắc thể khá khó khăn . Trạng thái bội
thể này có ý nghiã tiên lƣơ ̣ng vào vi

ệc dự báo kết quả điều trị ở các bệnh nhân u

nguyên bào thần kinh dƣới 1 tuổ i nhƣng không có ý nghĩa tiên lƣ ợng đối với các bệnh
nhân lớn. Điều này có thể là do ở các bệnh nhân dƣới 1 tuổ i thể đa bội hay gần tam
bội có thêm cả nhiễm sắc thể mà không có các biến đổi cấu trúc, trong khi với các
bệnh nhân lớn hơn, các biến đổi này đi kèm với sự thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể
[36].

17


1.3.2.2 Các biến đổi liên quan đến cấu trúc nhiễm sắc thể
 Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 (1p)
Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy ở khoảng 35% số ca u
nguyên bào thần kinh. Các mất đoạn trên nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy
nhiều hơn ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh giai đoạn muô ̣n , và mất
đoạn dị hợp tử 1p rất hay đi kèm với sự khuếch đại MYCN. Ý nghĩa tiên lƣợng
độc lập của mất đoạn dị hợp tử 1p vẫn còn đang đƣợc tranh luận nhƣng các
bằng chứng hiện nay chỉ ra rằng mất đoạn dị hợp tử ở vị trí 1p36 đi kèm với kết
quả điều trị thấ p và là yế u t ố tiên lƣợng xấ u ở các b ệnh nhân nguy cơ thấp và
trung bình [4].
 Thêm đoạn ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 (17q)
Biến đổi di truyền hay gặp nhất ở các bệnh nhân u NBTK là thêm đoạn ở cánh
dài nhiễm sắc thể số 17 (17q) (khoảng 50% số ca). Bên cạnh một phần nhất
định số ca thêm đoạn 17q là kết quả của sự thêm đoạn không cân bằng xảy ra
độc lập, phần nhiều các trƣờng hợp là do sự chuyển đoạn không cân bằng giữa
17q và nhiễm sắc thể khác. Vị trí chuyển đoạn với 17q hay gặp nhất là 1p, và

19


khối u ở giai đoạn 3 hoặc 4 với sự tiến triển chậm, và hay tử vong (tỷ lệ sống trong 5
năm là 40 – 50%). Nhóm còn lại với sự xuất hiện của mất đoạn dị hợp tử 1p và
khuếch đại MYCN. Đây là nhóm có tính chất ác tính nhất, có sự tiến triển của bệnh rất
nhanh. Các bệnh nhân thuộc nhóm này thƣờng từ 1 – 5 tuổi, ở giai đoạn 3 hoặc 4 và
hầu hết là tử vong (tỷ lệ sống trong 5 năm là 25%).
Về sự di truyền của u nguyên bào thần kinh trong gia đình, cho đến thời điểm
này vẫn chƣa có một bằng chứng cụ thể nào về sự di truyền bệnh qua các thế hệ. Các
nhà nghiên cứu chỉ nhận thấy rằng độ tuổi chẩn đoán ở các đứa trẻ có u NBTK di
truyền là 9 tháng, trong khi độ tuổi này trong quần thể là 18 tháng. Và ít nhất 20% u
nguyên bào thần kinh di truyền có các khối u tiên phát ở cả hai bên thận hoặc tại nhiều
vị trí khác nhau. Đã có rất nhiều các bất thƣờng di truyền (nhƣ mất đoạn 1p) đƣợc
nghiên cứu, song cho đến nay vẫn chƣa có bất thƣờng nào có tính đặc hiệu và làm
tăng tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đƣợc tìm ra[42]
1.5 Tính cấp thiết của đề tài
Trƣớc đây, việc phân loại bệnh nhân lựa chọn pháp đồ điều trị và tiên lƣợng
bệnh gặp nhiều khó khăn vì chỉ dựa vào các chỉ số sinh hóa và kết quả giải phẫu bệnh
có độ chính xác không cao[4].Gần đây chỉ có một vài nghiên cứu nhỏ lẻ của Thạc sĩ
Vũ Đình Quang và cộng sự về kết quả đánh giá khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân
u nguyên bào thần kinh[2]. Vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu này để đánh giá một cách
có hệ thống kết quả khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại
bệnh viện Nhi TW. Từ đó kết quả này sẽ hỗ trợ bác sĩ lâm sàng trong việc phân loại
và lựa chọn pháp đồ điều trị phù hợp nhất cho bệnh nhân.
Nội dung nghiên cứu của luận văn:
-

Phát hiện đƣợc sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần
kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ