VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------

--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KRAS
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn

: TS. NGUYỄN HUY HOÀNG

Sinh viên thực hiện

: NGHIÊM THỊ BÍCH HẠNH

Lớp

: 11 -04, CNSH

HÀ NỘI, 5 - 2015


LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng
– Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Người thầy đã tận tình hướng

DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1.Ung thư đại trực tràng ........................................................................................ 4
1.1.1 . Khái niệm ung thư ........................................................................................ 4
1.1.3.Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng ................ 5
1.1.4. Chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng .................................................. 6
1.1.4.1. Chẩn đoán bằng lâm sàng và sinh hóa ......................................................... 6
1.1.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 7
1.1.4.3.Điều trị bệnh ung thư đại trực tràng ............................................................. 7
1.1.5.2. Tình hình ung thư đại trực tràng ở Việt Nam............................................... 9
1.2. Gen KRAS......................................................................................................... 9
1.2.1. Cấu trúc gen KRAS ........................................................................................ 9
1.2.2. Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với liệu pháp
phân tử đích ........................................................................................................... 11
1.2.3. Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực
tràng trên thế giới và tại Việt Nam. ........................................................................ 12
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 14
2.1.Vật liệu và hóa chất ......................................................................................... 14
2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 14
2.1.2. Hóachất ....................................................................................................... 14
2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................ 15
2.2 . Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 16
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số .............................................................................. 16
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose ...................................................................... 18
2.2.3. Đo quang phổ DNA .................................................................................... 19

Nghiêm Thị Bích Hạnh

ii



Base pairs

DNA

Axit deoxyribonucleic

CRC

Colorectal cancer

cDNA

Complementary DNA

dNTP

Deoxynucleotit triphosphat

ddNTP

Dideoxynucleotide

EGFR

Epidermal growth factor receptor

E.coli

Escherichia coli


Marker

PCR

Polymerase chain reaction

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Nhiệt độ nóng chảy

UV

Ultraviolet

WHO

World health oganization

PFS

Progression free survival

KRAS

Kirsten – ras/V – ki – ras 2 kirsten rat

Cysteine

G

Gly

Glycine

K

Lys

Lysine

M

Met

Methionine

T

Thr

Threonine

V

Val


Hình 9. DNA nhân bởi cặp mồi KR3 có kích thước 375bp .................................... 28
Hình 10. Đột biến dị hợp tử M67V ở bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17. ............ 29
Hình 11. Đột biến dị hợp tử V103D ở bệnh nhân KR7. ......................................... 30
Hình 12. Đột biến dị hợp tử M111K ở bệnh nhân KR7, 9. ..................................... 30
Hình 13. Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS. A:
cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 67; B: cấu trúc của protein KRAS
khi bị đột biến tại vị trí M67V. .............................................................................. 32
Hình 14. Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS. A:
Cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 103; B: Cấu trúc của protein
KRAS khi bị đột biến tại vị trí V103D. .................................................................. 32
Hình 15. Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS. A:
Cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 111; B: Cấu trúc của protein
KRAS khi bị đột biến tại vị trí M111K. ................................................................. 33

Nghiêm Thị Bích Hạnh

vii

Lớp 11 - 0 4


MỞ ĐẦU
Theo báo cáo thường niên của Viện nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ, hàng năm thế
giới có thêm khoảng 12 triệu ca ung thư mới và khoảng 7,6 triệu ca tử vong, tức
trung bình mỗi ngày có hơn 200 nghìn bệnh nhân ung thư tử vong. Riêng khu vực
Đông và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam hàng năm có thêm khoảng 3,6 triệu ca
ung thư mới với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân tử vong [34].
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) là loại ung thư hay gặp đứng
hàng thứ 2 ở nữ và hàng thứ 3 ở nam giới trên thế giới [17]. Đây là nguyên nhân
gây tử vong đứng hàng thứ 4 sau ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư gan trên

như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị... họ còn được hướng dẫn điều trị theo một liệu pháp
mới hiệu quả hơn, ít độc hại hơn, đó là “ liệu pháp phân tử đích”. Liệu pháp mới
cho thấy có nhiều ưu điểm, đặc biệt khi bệnh nhân điều trị bằng hóa học thất bại,
liệu pháp mới này tác dụng phụ ít, khi sử dụng kết hợp liệu pháp mới với phương
pháp hóa học sẽ giúp kéo dài sự sống hơn cho bệnh nhân.
KRAS là một proto – oncogene liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư. KRAS
mã hóa cho một GTPase nhỏ gồm 188 hoặc 189 aa, tham gia vào quá trình truyền
tín hiệu nội bào. KRAS nằm trong con đường truyền tín hiệu của EGFR. Protein
KRAS hoạt động như một công tắc phân tử trong con đường truyền tín hiệu nội bào
trong đó quy định các chức năng quan trọng cho sự tiến triển của tế bào, bao gồm cả
sự biệt hóa, sự phát triển và chết theo chu trình. Các đột biến trên gen KRAS dẫn
đến hoạt động GTPase của protein KRAS bị suy giảm, GTP không bị cắt thành
GDP, khi đó hoạt động truyền tín hiệu của protein KRAS sẽ diễn ra liên tục mà
không cần tới sự có mặt các kích thích của đường truyền tín hiệu EGFR/HER [27].
Đột biến gen KRAS xuất hiện sớm trong ung thư đại trực tràng và chiếm khoảng 30
- 40% [3]. Vì vậy, bệnh nhân có đột biến gen KRAS có phản ứng kém khi điều trị
với các thuốc ức chế EGFR. Đột biến gen KRAS thường xuyên nhất ở các codon 12,
13, 61 và 146 [6]. Các phương pháp xác định đột biến hiện nay chủ yếu là sinh học
phân tử như: tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn nhờ những mồi đặc hiệu,
đọc trình tự các đoạn được nhân lên và tìm đột biến.
Trong nghiên cứu của đề tài này, với mong muốn hướng tới áp dụng liệu pháp
điều trị đích cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên người bệnh ở Việt Nam,
trước hết nghiên cứu cần tìm hiểu về đột biến trên gen KRAS, vùng đột biến thường
xuyên xuất hiện, kiểu đột biến, các phương pháp kỹ thuật được áp dụng để tìm đột
biến, để từ đó bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân cụ
thể giúp giảm thời gian và chi phí điều trị cho bệnh nhân.
Xuất phát từ vấn đề trên, khóa luận: “Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam” được tiến hành với nội dung nghiên cứu
bao gồm:


1.1.1 . Khái niệm ung thư
Theo định nghĩa của WHO: Ung thư là một thuật ngữ chung cho một nhóm
lớn các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể. Các tế bào phân chia
và phát triển không kiểm soát được, hình thành các khối u ác tính và xâm nhập vào
các bộ phận ở gần hoặc xa cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết hoặc máu của cơ
thể gọi là di căn. Di căn là nguyên nhân chính gây ung thư.
Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lẻ. Việc chuyển đổi từ một tế bào bình
thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường là một sự tiến
triển từ một tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính. Những thay đổi này là
kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của người và các tác nhân bên
ngoài, bao gồm:
Tác nhân vật lý, như bức xạ tử ngoại và bức xạ ion hóa.
Tác nhân hóa học, như amiang, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxi
(chất gây ô nhiễm thực phẩm) và thạch tín (một chất gây ô nhiễm nước uống).
Tác nhân sinh học, như nhiễm trùng virut, vi khuẩn hoặc ký sinh trùng.
Cũng theo WHO, ung thư là nguyên nhân hàng đầu trên thế giới dẫn đến tử
vong và chiếm 7,6 triệu ca tử vong (khoảng 13% trong tất cả các ca tử vong) năm
2008, các loại ung thư chính là:
−

Phổi (1.370.000 trường hợp tử vong)

−

Dạ dày (736.000 trường hợp tử vong)

−

Gan (695.000 trường hợp tử vong )


manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, gần 60% ung thư nằm tại đại tràng trái
bao gồm: đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng [28].

Hình1. Cấu trúc của ruột già.
Những khối u lành tính được gọi là polyp, khối u ác tính được gọi là ung thư
đại trực tràng. Những khối u polyp lành tính không thể xâm lấn vào những mô lân
cận và không thể lan tràn đến những cơ quan khác trong cơ thể. Những polyp này
thường có thể cắt bỏ dễ dàng trong tiến trình nội soi đại trực tràng và không nguy
hại đến đời sống bệnh nhân. Nếu polyp không được cắt bỏ, nó có thể trở thành ác
tính (ung thư hóa polyp) một thời gian sau đó. Ung thư đại trực tràng có thể xâm lấn
và gây tổn hại mô và cơ quan lân cận. Ung thư cũng có thể lan tràn đến các cơ quan
khác trong cơ thể như phổi hay gan.
1.1.3.

Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực

tràng
Cho tới nay, cũng giống như nhiều loại ung thư khác người ta cũng chưa biết

Nghiêm Thị Bích Hạnh

5

Lớp 11 - 0 4


được nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng. Trên 75-95% ung thư đại trực tràng
xuất hiện ở những người không có liên quan tới yếu tố về gen [24], [7].
− Các polip đại trực tràng: Phần lớn ung thư đại trực tràng xuất hiện từ các
polyp ung thư hóa. Polyp tuyến là loại hay ung thư hóa khi mà kích thước >1cm.

Lớp 11 - 0 4


- Xét nghiệm máu trong phân: Đôi khi các ung thư hay các u thịt (các polip)
gây chảy máu, và xét nghiệm phân có thể phát hiện một lượng nhỏ máu. Nếu xét
nghiệm này cho thấy có máu, khi đó các xét nghiệm khác là cần thiết để tìm nguồn
gốc của máu. Các tình trạng lành tính (như bệnh trĩ), cũng có thể gây ra máu trong
xét nghiệm này.
- Sự bơm thụt bari tương phản kép: Thủ thuật này liên quan đến việc làm đầy
đại tràng và trực tràng với một chất lỏng màu trắng (Bari) để nâng chất lượng các
hình ảnh X-quang. Các bất thường (như các bướu thịt- polip) có thể được nhìn thấy
rõ ràng.
- Soi đại trực tràng sigma: Bác sĩ kiểm tra trực tràng và phần dưới của đại
tràng với một ống sáng (ống soi đại trực tràng sigma). Sự phát triển tiền ung thư và
ung thư trực tràng và phần dưới của đại tràng có thể được tìm thấy và hoặc được lấy
ra hoặc được sinh thiết.
- Nội soi ảo đại tràng: Trong xét nghiệm này, thiết bị X-quang đặc biệt được
sử dụng để đưa ra các hình ảnh của đại tràng và trực tràng. Một máy tính tập hợp
những hình ảnh này thành các hình ảnh chi tiết mà nó có thể hiển thị các bướu thịt –
polip và các bất thường khác [31].
1.1.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử
Nền tảng của phương pháp này là kỹ thuật PCR dùng những cặp mồi đặc hiệu
để nhân đoạn gen mong muốn, từ đó giải trình tự tìm ra đột biến. Những đoạn gen
thường dùng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng là KRAS, p53 và APC. Thêm vào
đó, ưu điểm của phương pháp này là phát hiện trực tiếp được cũng như kiểm tra
được khả năng mắc bệnh ngay từ bố mẹ để từ đó dự đoán khả năng mắc bệnh ở con
cái. Trong khóa luận này, chúng tôi sẽ tập trung vào nghiên cứu trên gen KRAS.
1.1.4.3. Điều trị bệnh ung thư đại trực tràng
Phẫu thuật cắt bỏ khối u vẫn là phương pháp điều trị hiện nay, bên cạnh đó các
phương pháp hóa trị, xạ trị và liệu pháp phân tử đích cũng đang trở thành một phần

2006 [14].
Hai tác nhân sinh học này là các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu là thụ thể
yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor-EGFR). Cetuximab
(Erbitux) là một kháng thể khảm đơn dòng (chimeric monoclonal antibody) đã được
phê duyệt như đơn trị liệu hoặc kết hợp với irinotecan (camptosar) ở những bệnh
nhân ung thư đại trực tràng di căn không đáp ứng với điều trị fluoropyrimidine và
oxaliplatin. Panitumumab (vectibix) là kháng thể đơn dòng hoàn toàn của người
hiện nay được chỉ định như một đơn trị liệu cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng
không thành công hoặc không dung nạp với hóa trị liệu kết hợp. Một thử nghiệm
gần đây của Hecht và cộng sự [32], đánh giá panitumumab phối hợp với
becvacizumab và hóa trị liệu (dựa trên oxaliplatin và irinotecan) như điều trị bước
đầu cho ung thư đại trực tràng di căn đã kết luận rằng việc bổ sung panitumumab
gây tăng độc tính và giảm tỷ lệ sống còn không diễn tiến bệnh.

Nghiêm Thị Bích Hạnh

8

Lớp 11 - 0 4


1.1.5.1. Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới
Theo Tổ chức Y tế thế giới, trong năm 2012, trên thế giới có 1,4 triệu người
được chẩn đoán bị ung thư đại trực tràng, chiếm 9,7% tổng số các loại ung thư, là
loại ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới sau ung thư phổi (1,8 triệu, 13%) và ung
thư vú (1,7 triệu, 11,9%).
Theo số liệu thống kê của Globocan 2008, ung thư đại trực tràng là bệnh ung
thư phổ biến thứ ba ở nam giới (chiếm 10% tổng các loại ung thư) và thứ hai ở nữ
giới (chiếm 9,4% tổng các loại ung thư). Gần 60% các trường hợp ung thư đại trực
tràng xảy ra ở các nước phát triển (tỷ lệ mắc bệnh cao gấp 10 lần ở cả hai giới so

sự biệt hóa, sự phát triển và chết theo chu trình [3].
Gen KRAS có tên chính thức là sarcoma rat kirsten virus homolog oncogene,
được xác định vào năm 1975 từ các nghiên cứu của loại virus gây ung thư là virus
sarcoma kirsten bởi Scolnick và cộng sự [ 3]. Gen K-RAS nằm trên cánh ngắn của
nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1: (12p12.1). Cụ thể là các gen K-RAS nằm từ nucleotid
25358179 đến nucleotid 25403853 trên nhiễm sắc thể 12.

Hình 2. Vị trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12. ( McGrath J.P. (1983))
Sản phẩm của gen KRAS là protein KRAS chứa 188 amino acid có khối lượng
phân tử 21,6 kD, và tham gia dẫn truyền tín hiệu nội bào [19]. Có hai vùng quan
trọng là Switch 1 (30-38 aa) và Switch 2 (59-67 aa) hình thành nên vòng phản ứng
lại kích thích, điều khiển bởi đặc trưng liên kết của GTPase với phân tử phản ứng
kích thích của nó. Vùng Switch I và II đóng vai trò quan trọng trong liên kết của
yếu tố điều hòa và yếu tố ảnh hưởng .

Nghiêm Thị Bích Hạnh

10

Lớp 11 - 0 4


Hình 3. Mô hình protein KRAS với các vùng quan trọng được đánh dấu.
1.2.2. Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với
liệu pháp phân tử đích
Gen K-RAS là gen sinh ung thư, gen K-RAS mã hóa cho protein KRAS tham gia
chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào. Thông qua một quá trình truyền tín hiệu
(transduction), protein truyền tín hiệu từ ngoài tế bào vào đến nhân tế bào. Các tín hiệu
này kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia hoặc trưởng thành với những chức năng
chuyên biệt. Protein K-RAS là một GTPase, enzym có chức năng chuyển đổi phân tử

cơ chế phân tử lý giải cho tình trạng kháng thuốc điều trị đích ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng có đột biến trên gen KRAS [3].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung
thư đại trực tràng trên thế giới và tại Việt Nam
Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến trên gen KRAS có ảnh
hưởng đến hiệu quả điều trị bằng liệu pháp phân tử đích. Đột biến trên gen KRAS
xảy ra với tần xuất 17 – 25% ở tất cả các loại ung thư [3]. Tuy nhiên, tần xuất này
thay đổi ở mỗi loại bệnh ung thư bao gồm: 36% bệnh nhân ung thư đại trực tràng,
20% bệnh nhân ung thư phổi và 65 – 100% bệnh nhân ung thư tuyến tụy [20]. Tỷ lệ
này được xác định là 30 – 60% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 60% bệnh nhân
ung thư tuyến tụy, 33% bệnh nhân ung thư mật, 17% bệnh nhân ung thư buồng
trứng, 15% bệnh nhân ung thư màng trong dạ con và 30 – 40% bệnh nhân ung thư
phổi các loại [28].
Gần 90% đột biến làm mất hoạt tính của protein KRAS là đột biến tại codon
12 – 13 trên exon 1 và 5% là đột biến tại codon 61 trên exon 2. Amino acid 12 và
13 là vị trí GTP-binding P-loop và amino acid 61 nằm trên vùng switch-I [21].
Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, đột biến ở codon 12 và 13 trên gen KRAS
xảy ra ở 25 – 40% bệnh nhân [4]. Đột biến điểm ở codon 12 và 13 cũng được xác
định là gây ra đáp ứng thấp với việc điều trị bằng cetuximab và panitumumab ở

Nghiêm Thị Bích Hạnh

12

Lớp 11 - 0 4


bệnh nhân ung thư đại trực tràng [6]. Vì vậy, đột biến này là một chỉ thị phân tử
quan trọng cho việc sử dụng liệu pháp phân tử đích với chất ức chế thụ thể EGFR.
Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về ung thư đại trực tràng, nhưng


hãng Thermo (Mỹ) dùng để tách chiết DNA tổng số.
•

Bộ KIT GeneJET Gel Extraction của hãng Thermo (Mỹ) dùng để tinh

sạch sản phẩm PCR.
•

Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, buffer,

dNTP, mồi đặc hiệu.
•

Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE 1X, dye,

ethydium bromide.
•

Và một số hóa chất khác như nước cất một lần, ethanol,...

Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR nhân đoạn exon trên gen KRAS được
tổng hợp ở HãngIDT (Mỹ) (bảng 1).
Bên cạnh đó, dựa vào trình tự DNA chuẩn của đoạn gen KRAS, 3 cặp mồi xuôi
và ngược được thiết kế để nhân những đoạn exon của gen KRAS nhờ kỹ thuật PCR.
Bảng 1: Trình tự 3 cặp mồi dùng cho PCR.
TT

Tên mồi


5’-TA ATG GAT CAT GGG CCA TGT-3’

6

KR3R

5’-AC AGT GTT GAA TGT GGT GCA-3’

Nghiêm Thị Bích Hạnh

14

Kích thước
445bp
297bp
375bp

Lớp 11 - 0 4


2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm:
- Tủ lạnh -200C Vestfrost (Đan Mạch);
- Máy li tâm BioFuge fresco (Đức);
- Lò vi sóng Sharp (Nhật Bản);
- Cân điện tử Precisa (Thụy Sỹ);
- Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ);
- Máy chụp gel BioRad (Đức);
- Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản);
- Máy điện di Mupid -2plus (Nhật Bản);

chính sau:

Nghiêm Thị Bích Hạnh

16

Lớp 11 - 0 4


Phá màng tế bào

Loại protein, màng tế bào và chất hữu cơ khác

Loại bỏ RNA

Thu DNA tổng số

Hình 5. Các bước tách chiết DNA cơ bản
DNA tổng số được tách từ mẫu máu bằng bộ KIT GeneJET Whole Blood
Genomic DNA purification Mini Kit của hãng Thermo. Quy trình tách bao gồm
những bước tiến hành sau:
Bước 1: Dùng pipette lấy 20 µl protease K vào ống eppendorf 2 ml, protease
K có tác dụng phá vỡ màng tế bào, thủy phân protein trong mẫu.
Bước 2: Thêm 200 µl mẫu máu vào ống eppendorf nói trên.
Bước 3: Thêm 400 µl lysis solution vào ống rồi spin để dung dịch trên thành
ống rơi hết xuống đáy.
Bước 4: ủ ở 56 0C trong vòng 10 phút.
Bước5: Tiếp tục spin một lần nữa để những chất dính trên thành ống rơi hết
xuống đáy.
Bước 6: Thêm tiếp 200 µl ethanol (96%) rồi lại spin.