ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì........................................................4
1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng.....................................4
1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]....6
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG.......................8
1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì...................................................................8
1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng.....9
1.4. CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC
TRÀNG.......................................................................................................................16
1.4.1. Chemokine................................................................................16
1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4......................19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở
BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG......................................................21
2.1. NGUYÊN LIỆU..................................................................................................23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................23
2.1.2. Hóa chất.....................................................................................23
2.1.3. Thiết bị......................................................................................24
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................24
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô.................................................24


2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR..................27
2.2.4. Phân tích RFLP.........................................................................28
2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật
MSP................................................................................................................29
2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm........................................................32
2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc..................................................................33
2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê..........................34
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................35
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP...............................................................35
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu.......................................35

AJCC

American Joint Committee on Cancer

APC

Adenomatous polyposis coli

APS

Ammonium persulfate

CEA

Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN

Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP

CpG island methylator phenotype

CRC

Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng)

cs


LOI

Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MSI

Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)

MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PI3KCA

Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit


PCR- RFLP

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism

TNM

Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

NST

Nhiễm sắc thể


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học

Bảng 2

Các chemokine thuộc họ CXC

Bảng 3

Các thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4

Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme
FastDigest MspI


Bảng 12

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13

Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo
các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2

Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4

Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư
đại trực tràng


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU
Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng
hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến
triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để
thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở
giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh
ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại
ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai
gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại
ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn
uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng
ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều
trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng
[30].
Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm,
có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. Mục
tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn
đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có
carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán
bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn
rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát

2


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thư
Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển
không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách
không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển
của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở
xa) (bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học
U lành tính
- Tế bào biệt hóa cao
- Phân bào ít và chậm
- Không xâm lấn xung quanh
- Có vỏ bọc
- Không hoại tử
- Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể

U ác tính (ung thư)
- Tế bào ít biệt hóa
- Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm
soát của chu trình tế bào
- Xâm lấn xung quanh


Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng
Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư
đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau
đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:

4


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

• Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào
trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm
mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu.
Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những
polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp
trở thành ung thư.
• Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ
ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại
trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực
tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thư đại trực tràng.
• Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Người bị chứng bệnh gây viêm đại
tràng (như chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc
bệnh cao.
• Bệnh sử ung thư cá nhân: Người từng bị ung thư đại trực tràng có thể sẽ
lại bị ung thư đại trực tràng lần thứ hai. Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thư buồng

- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.
Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)
Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint
Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên
những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ
sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng.
Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng
U nguyên phát (T):
Tx – không xác định được u.
T0 – không có bằng chứng của khối u.
Tis – u tại chỗ (niêm mạc).
T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc.
T2 – u xâm lấn thanh mạc.
T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh
đại tràng hay trực tràng.
T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.

6


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hạch lympho vùng (N):
Nx – không xác định được hạch.
N0 – không có hạch di căn.
N1 – di căn 1-3 hạch xung quanh đại tràng hoặc trực tràng.
N2 – di căn từ 4 hạch trở lên.
N3 – di căn đến bất kì một hạch nào dọc theo mạch máu chính.

đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một
chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng
bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh
giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng
dược của quá trình điều trị [18].
Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ
hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc
kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng
các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ như đột biến dòng phôi
gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo
của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là
một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị
phân tử hiện nay được ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy
và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có
liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều
trị ung thư.

8


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chỉ thị phân

Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm
soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư.
Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng
trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các
trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà
phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp
đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated
protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào,
tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu
dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào.
Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột
biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các
ung thư đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trường hợp ung thư có kiểu
hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16]. Năm
2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thư) cho thấy
đột biến này có vai trò chuyển ung thư đa u tuyến từ giai đoạn trung gian.
Sự methyl hóa ADN
Như đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột biến trong gen gây
ung thư, các gen gây ức chế khối u gây ung thư, tuy nhiên chỉ khoảng 10% bệnh
nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này. Ngoài ra, sự phát sinh ung thư còn có
thể do cơ chế biến đổi ngoại di truyền gây ra.
Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện gen mà sự
biến đổi này không phải do những biến đổi trình tự base trên ADN, bao gồm sự
methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truyền ngoại sinh được nghiên
cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN.
Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của vòng

methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% như ở Cyclin A1,…
Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cường methyl hóa cao ở các
gen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần như
là 0% ở người bình thường, điều đó cho thấy tình trạng tăng cường methyl hóa
ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thư đại trực tràng
[12]. Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu
mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.

11


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi được tối
ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác
biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thư và người bình
thường, cho thấy rằng đây có thể là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm
bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thư đại trực tràng.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN
QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Đây là kĩ thuật truyền thống, được sử dụng để lập bản đồ gen, xác định đột
biến điểm. Kĩ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư ở cấp độ
đột biến gen.
Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzyme giới
hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh
nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo

DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
Đây là phương pháp phân tích ADN dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân
tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN
được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau
và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử
dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. DHPLC
là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với những tiến bộ
gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương
pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.
Real Time PCR
Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN
được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát
hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của
một mẫu ADN. Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc
hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn
huỳnh quang. Qua mỗi chu kì của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự
gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang. Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định
lượng chính xác lượng sản phẩm. Đây được coi là hướng tiếp cận mới so với PCR
chuẩn, được sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán.

13


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Giải trình tự
Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột
biến điểm/SNPs. Để khẳng định chính xác đột biến hay biển đổi người ta phải giải