t bin gen tARN và ND3 ca ADN
ty th  bi trc tràng Nguyn Th Ngc Tú

i hc Khoa hc T nhiên
Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30
ng dn: PGS.TS. Trnh Hng Thái
o v: 2012 Abstract: Tng quan v t bin Gen tARN và ND3 ca ADN ty th  bnh nhân ung
i trc tràng: Ty thi trt bin ADN ty th và b
i trc tràng. Tin hành nghiên cu: Tách chit ADN tng s t mô; 




gen 10398  3243 

 n di kim tra
sn phm PCR và sn phm ct bng enzym gii hn; Tinh s
giá các kt qu c: Kt qu t bim A3243G ca Gen tARN Ty th
bng k thut PCR-RFLP; Kt qu a Gen ND3 ADN Ty
th bng k thut PCR-RFLP.

Keywords: Sinh hc thc nghim; t bin gen; i trc tràng; Ty th; Di
truyn hc hóa sinh
trc tràng bng k thut PCR-RFLP.
 i liên 

 t bin gen tARN và ND 3  ADN ty th vi các
m lâm sàng ca 

i trc tràng  i Vit Nam.
 c thc hin ti phòng Proteomics và Sinh hc cu trúc thuc Phòng thí nghim
Trm Công ngh Enzym và i hc Khoa hc T i hc Quc
gia Hà Ni.
- 


Ty th có cht h di truyn t lp khác vi h di truyn ca nhân
t bào. ADN ty th là phân t si kép, dc 16569bp, gm hai chui khác
nhau v thành phn nucleotide: chui nng có cha nhiu guanine, chui nh cha nhiu
cytosine. Chui nng mã hóa cho 28 gen, chui nh mã cho 9 gen trong tng s 37 gen ca h
gen ty th. Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chui polypeptide cn thit cho h thng
phosphoryl hóa oxy hóa. S gen còn li ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong s dch
mã ca ty th [10] ( 1). Các chui polypeptide còn li cn thit cho cu trúc và ch
ca ty th c ghi mã bc tng hp trong ribosome ca t bào cht.
Các nghiên cu trên ADN ty th cho thy h gen ty th có nh
bit vi h gen nhân. H gen ty th c tính di truyn theo dòng m, có t n vài
nghìn bn copy trong mt t bào. Các t bào khác nhau có s ng bn copy khác nhau, tùy
thuc vào nhu cng trong mô [60]. H gen ty th không có vùng intron và các gen
không có, hoc có rt ít các bazo không mã hóa  gia chúng. Trong nhing hp không
xut hin các codon kt thúc mà ch có s polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy
nht trong h gen ty th không tham gia mã hóa. Vùng D-c 1,1 kb cha các
yu t quan trng cho quá trình phiên mã và d a promoter phiên mã ca chui
nng và chui nh, có vùng gn vi các yu t phiên mã ADN ty th-Loop xy ra

Hình 2. Các bn ri lon ADN ty th [64]
t bin ADN ty th gây ra các bnh  c phát hin.
Các bnh này có th xut hin  bt k n nào trong cui, t a bé mn
ng thành  mi la tui. Ngoài ra, nhit bic di truyn theo dòng m, bi
vy mà nhng chi có th c dùng cho nhiu th h  [57].
Các nghiên cu cho tht bin ADN ty th n tình trn kinh và tim
mt bin ty th gây bnh bao gt bit bin mn có liên quan
ti các bnh  i, hu ht trong s n h thi biên.

Mi liên quan gia s mt cha ty th vi bc Otto Warburg
lu tiên phát hin ra t nh thit rng s  ca quá trình
ng phân hiu khí trong nhiu loi mô u là do s i chui hô hp trong nhng t bào này
[70]. Theo Warburg, mt s bii ca ty th t bin ca
ADN ty th, nhng bii trong s biu hin và hong ca các ti ca chui hô
hp.
Hong ca chui hô hp ca ty th có liên quan vi s to thành các loi oxy phn
ng (Ru kin các electron b tha quá mc (ví d 
khi nhu cc do s c ch phc h enzym chui hô hc to ra
rt nhiu. S a ROS, hoc stress oxy hóa có th t bin ADN ty th 
hi các thành phn lipid và protein ni bào. H gen ty th c bit d dàng chu tác dng ca
ROS do phân b gn chui hô hp, kh g sa cha sai hng b gii hn [51]t bin ADN
ty th có th gây ra s biu hing ca các ti thuc chui vn chuyn t
c mã hóa bi ADN ty th, dn làm gi hong ca chui vn chuyn t,
gim kh  oryl hóa oxy hóa. Khi chui vn chuyn t b suy gim v chc
 n quá trình to thành ATP và ROS, làm bin ði s biu hin ca mt s
u hòa protein và quá trình tng hp nucleotide ca t bào.
y bii ca h gen ty th n b[27]. Mt s t bin ADN ty
th nh trong nhiu loi trc tràng, bung
trng, rut, gan, ty, tuyn tin lit, pht bin ADN ty th có th xut hin  vùng ghi mã
và vùng không ghi mã [19] (hình 3). n nay nhiu dng bii ADN ty th c xác

i có 2 hon lp li k tip nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Bii v s bn sao ADN ty th c phát hin  nhiu loi b bn
sao ADN ty th  n giáp [47], i [15]i trc tràng [44].
Bing gim s bn sao ADN ty th nh thy  b[63],
u mô t bào gan [42],  ng trng [69]y bii v ng
ADN ty th có liên quan vi lo
i ta cho rng s ng bn sao ADN ty th trong b ph thuc v
trí ct bin trong b t bin trong vùng D-u khin s
nhân bn ADN ty th s làm gim s bn copy. Mt bin ADN ty th  các gen mã hóa
cho các protein ca chui phosphoryl hóa oxy hóa li có th  bt
 ng li s mt cha ty th [38].


i trc tràng hay còn gt kt (colon cancer) bao gi
i tràng là phn rut ln hình ch N bao gn rut kt lên
n xung (descending colon). Trc tràng
(rectum) là phn rut th  cha phân, ni gi i tràng và hu môn (hình 4).  
ng xy ra  n ni gii tràng và trng hai lo vi
nhau và khó có th y y ra sau vì th c
gi trc tràng [79].

Hình 4. Hình i trc tràng [76].
i trc tràng là mt trong nhng lo bin nht trên th gii hin
nay, chim t l cao th ng hc ch
th gii có khong 1 triu ca mc mi và trên na triu ca t vong. T l mc bnh không ging
c tính t l bnh nhân  c phát trin (M, Nht) cao gp 410 l
phát trin. Trên thc t, s ng bnh nhân  c 
s già hóa dân s i si trng 


Leu (UUR)




 






 nh MELAS [31].  3243






 


















 c h c

 [28].
1.3.2 
V trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong h genom ty th 


 này làm bii Threonine (alen A) thành Alanine (alen G)  u C c
ND3 ca phc h I ca chui hô hnh thoái hóa thn kinh
tunh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bng [48]. Ngoài ra trong
mt nghiên cu ca các nhà khoa hc Trung Qu

 10398AG
 [34].
A10398G là mt trong nhc s quan tâm ca nhiu nhà khoa hc bi
nó có liên quan vi vic to thành nhng khi u. Canter và cs (2005) lu tiên phát hin mi
liên quan gii bi ph n M g
không thy mi liên h nào  i M da trng. Các tác gi cho rng s a các yu
t ng có th gây ra s khác nhau gia các ti [18]. Tuy vy, trong mt s
nghiên cng là ph n M gc Phi không thy vai trò ci
vi s phát trin c[55]. Trong nghiên cu này, các tác gi i thích s khác
nhau v kt qu ca các nghiên cu này là do s khác nhau cu kin trong các khu vc
a lý khác nhau. Bai và cs (2007) khi nghiên ci ph n M gc Âu mc bnh

nhy cao.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)
 dng ct sc ký k  sc ký l phân
tách ADN d si kép (heteroduplex) v ng si kép (homoduplex) ti nhi ti u. Các mch
c phân tách  nhi cao, sau khi h nhi xung, chúng liên kt vi nhau và hình
thành ADN d si kép cha các c d si kép này có thi
gian di chuyn khác bit so vi sng [43]. Nhiu nghiên c d
 sàng lc toàn b genome ty th, hoc mt vùng nhnh ca ADN ty th  xác
t bin ng m ng nht ca ty thnh mi quan
h gia din tích cnh sc ký có d si kép và m ng nht ca ty th
t bin ADN ty th thp ti 1% [43].

n nay các nghiên cu v t bin ADN ty th  i Vit Nam vu,
s liu còn hn ch  thng.
u gii mã genome ty th các ti Vit Nam
y mt s bii ca ADN ty th  i Vit Nam thuc vùng D-loop, các gen ND1,
ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8.
Ngoài ra, trong nghiên ct bin A3243G  bnh nhân mc bnh MELAS
(2/34 bt bin) [2].
   d  PCR-RFLP kt hp gii trình t
nh tht bin A3243G có mt  bnh nhân và m bnh nhân trong mt gia
i mc hi chng MELAS [4].
Ph di trình t trc tip ADN ty th
tách chit t máu bnh nhân mang bnh tht bin ADN ty
th, 7 trong s t bit bin nng gp nht, 2 ca còn
lt bin T14484C [8].
Nhóm nghiên cu ca Nguyn H    d   i trình t tách
nh thy nhit bin (ti 14 v trí) trên vùng D-Loop  mng
ng xuyên tip xúc vi bc x ion hóa [5].
t bin ADN ty th  bi Vit Nam, kt

M
QIA amp DNA minikit
c)
Tách ADN tng s
QIAquick Gel Extraction Kit
c)
Tinh sch ADN
Agarose
Invitrogen (M)
n di
SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide
Pharmacia (Thy
n)
Các cp mi 10398, 3243
IDT (M)
PCR
Master Mix 2X
NEB (M)
Enzyme Fastdigest® HaeIII
Enzyme Fastdigest®DdeI
Fermentas c)
RFLP

Các hóa ch base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat,
bc s d sch phân tích.

 tit bin A3243G và A10398G, chúng tôi thc hi
PCR-c ht ADN tng s c tách chit t mô u và mô lân cn u. Tin
ADN cht bic nhân lên bng PCR vi cp mc hiu. S có mt cn gen cha
t bi c kim tra bc tip theo chúng tôi thc hin ct

ng ADN trong mu khá cao và s u ki tin hành các thí nghim tip theo.

S dng cp mc hiu 3243 vi khuôn là ADN tng s t n gen cha v trí
3243 ADN ty th c khui bng phn ng PCR. Sn phm PCn di kim tra
trên gel agarose 1,7%, nhui tia cc tím. Kt qu c
th hihình 8.

Hình 7. n di sn phn gen 3243
(

 1,7%, nhum ethidium bromide).
Ging M100: thang chun ADN 100bp
Ging (-i chng âm
Ging 1, 3, 5: Sn phm PCR mu mô lân cn u

Ging 2, 4, 6: Sn phm PCR mu mô u

Kt qu n di cho thc sn phc 218bp, 
rõ nét và không xut hi chng t không có hing bt cc hiu. Sn
phc tip tc phân tích bng k thu t bin.
3.1.3. Kt qu n gen cha v trí 3243 ADN ty th
 t bim A3243G, chúng tôi s dhúng tôi 
tin hành x lý sn phm PCR n gen 3243 vi enzyme gii hn HaeIII. HaeIII là enzyme
endonuclease nhn bit ADN ti trình t:










  





 218 

 t v trí nhn bit na ca enzyme
gii hn, kt qu n gen s  22 bp, 27 bp, 72 


97 bp. Sn phm ca quá trình x lý vi enzyme cn di kim tra cùng vi sn phm
PCR trên polyacrylamide 6%, nhum ethidium bromide và qc sóng 245
nm (hình 9).

Hình 8.  3243 

 HaeIII.
(

 polyacrylamide 6%, nhum ethidium bromide).
Ging 1: Thang chun ADN 100bp
Ging 3, 5: sn phm PCR t mô u
Ging 7: sn phm PCR t mô lân cn u

Ging 2, 4: sn phm sau ct bng HaeIII t

nht (homoplasmic) [46]y có th thy rt bin A3243G là khá him gp  bnh

3.2. 
-RFLP

S dng cp mc hiu 10398 vi khuôn là ADN tng s t 
c khui bng phn ng PCR. Sn phn di kim tra
trên gel agarose 1,7%, nhui tia cc tím. Kt qu c
th hihình 10.
Hình 9. n di sn phn gen 10398
(

 1,7%, nhum ethidium bromide).
Ging M100: thang chun ADN 100bp
Ging (-i chng âm
Ging 1, 3, 5: Sn phm PCR mu mô lân cn u
Ging 2, 4, 6: Sn phm PCR mu mô u

Kt qu n di cho thc sn phc 246bp, 
rõ nét và không xut hi chng t không có hing bt cc hiu. Sn
phc tip t t bin.
3.2.2. Kt qu 
Chúng tôi  tin hành x lý sn phm PCR n gen 10398 vi enzyme gii hn DdeI.
DdeI là enzyme endonuclease nhn bit ADN ti trình t:
5
3
ng hp alen A xut hin  v trí 10398, enzyme DdeI có mt v trí nhn bin

Ging 7: sn phm PCR t mu mang alen A 
v trí 10398.
Ging 2, 4: sn phm sau ct bng DdeI t
mu mang alen G  v trí 10398.
Ging 6: sn phm sau ct bng DdeI t mu
mang alen A  v trí 10398.
tinh sc ly ra kim tra s hin din cng ADN tinh sch
c nm trong khong 200- s  i
trình t. S dng phn m

































 2  10370

10400T. Da
vào các d lic công b trên Mitomap (ngân hàng d liu genome ty th) thy rng hai
dng bin th này không liên quan tt bin gây bnh, mà ch 
bi M [62], còn bin th T10370C thuc dng bin
th ng, không gây bnh [50].
3.2.4. 







 10398




 c kt qu 

 12.
Bng 2. Phân b  A10398G  ADN ty th ca bi trc tràng
theo m bnh hc lâm sàng
m
S ng
Phân b A10398G
A
G
Gii tính
Nam
30
50,0
(15)
50,0
(15)
N
31
41,9
(13)
58,1
(18)
Tui
 50
46
47,8
(22)
52,2
(24)

(2)
33,3
(1)
13
15
60
(9)
40
(6)
>3
27
37
(10)
63
(17)
c u
<5cm
28
35,7
(10)
64,3
(18)
 5cm
22
59
(13)
41
(9)
Phân loi TNM
n I

42,9
(9)
57,1
(12)
n IV
M
1
T, N bt k
3
0
(0)
100
(3)
M bit hóa
Cao
5
60
(3)
40
(2)
Va
20
52,4
(11)
47,6
(9)
Kém
2
0
(0)

 (bao gm
mô u và mô lân cn  mi bnh nhân).  sch cn thic các
yêu cu thí nghim.
2. S dng các cp mc hi



 a v t bin
c 246 bp) ca ADN ty th t mu mô ca bnh
i trc tràng.
3. 









 10398G là 54 % mô u, 54 % 

 .
54%.
4.  

 10398G 




 .

References
Tài liu ting Vit
1.      u nghiên c   ú bnh nhân Vit Nam bng
  c phân t s dng ch th di truyn h gen ty th vùng D- Loop",
Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu cơ bản trong sinh học,
nông nghiệp, y học, pp. 825-830.
2.  n cu gii mã genome ty th các ti Vit Nam và
ng ng d tài cc (mã s: KC-04-25).
3. Nguyn (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xut bn giáo dc Vit Nam.
4. n (2009), "Tìm hiu bnh ty th  i bc phân
t : QT-08-31).
5. Nguyn Hng Trn Trung và Tt bin h gen ty
th vùng D-Loop  ng xuyên tip xúc vi bc x ion hóa", Tạp chí Y
học Việt Nam, 351, pp. 29-34.
6. Phan TuGiáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xut bn giáo dc
Vit Nam.
7.  (2008), Bệnh học các khối u, Nhà xut bn y hc Hà
Ni.
8. Phm Hùng Vân, Hoàng Hiu Ngc và Võ Quang Hng hp
u tiên v bnh lý thn kinh nhãn cnh bng k thut gii trình t DNA
ty th tách chit t bch cu ca b phát hit bin gây bnh", Kỷ yếu
hội nghị Sinh học phân tử và hóa sinh y học, pp. 285-289.
Tài liu ting Anh
9. Alonso A., Martin P., and Albarran C. et al (1997), "Detection of somatic mutations in
the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex
and single-strand conformation analysis", Electrophoresis, 18, pp. 682-685.
10. Anderson S., Bankier A. T., and Barrell B. G. (1981), "Sequence and organization of the
human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp. 457-465.