ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... c
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... d
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1- TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. TY THỂ........................................................................................................ 3
1.1.1. Hệ genome ty thể ................................................................................... 3
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể ....................................................... 5
1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư .................................................... 7
1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................................ 10
1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng ...................................................... 10
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng............................................... 11
1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học ......................... 12
1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20] ...................... 15
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .. 16
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể ..................................................... 17
1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể ................................................. 19
1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh ... 22
1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ...................................................... 24
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 26
2.1. NGUYÊN LIỆU ......................................................................................... 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................... 26
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ 27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 28
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ............................................................. 28
2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR . 29


2.2.3. Phân tích RFLP .................................................................................... 31
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32

Viết đầy đủ

bp

Base pair (cặp bazơ)

CPEO

Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ
ngoài tiến triển mãn)

cs

Cộng sự

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

KSS

Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre)

LHON



PCR

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

a


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)

ROS

Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

TBE

c


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. ........................................................ 4
Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] ........................................ 6
Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] ....................... 8
Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]. ..................................................................... 11
Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]. ........................... 15
Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]. ................................... 17
Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô ........................................ 37
Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 ............................................... 38
Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII........................... 39
Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398............................................ 41
Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI ......................... 42
Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G....................... 43
Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN
chuẩn của ty thể ..................................................................................................... 44
Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G ................................. 44
Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty
thể ......................................................................................................................... 45
Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô. .................................. 48
Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính.................................... 49
Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi. .......................................... 50

d

những đột biến do thay đổi các nucleotide [57].
Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể
được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y
học. Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang
phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh
chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các
dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề
tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế
giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới.
Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm
khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực
tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường
tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh
nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày

1


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể,
đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng”
với mục đích:
 Phát hiện đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân

truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước
16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa
nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen,
chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có
13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy
hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty
thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng
của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của
tế bào chất.
Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng
riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ,
có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số
lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ

3


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không
mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc
mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen
ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố
quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi
vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi
polypeptide được mã hóa trong ty thể [41].


xương, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm
sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của
bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa
trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học
phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học
trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan
đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong
quần cư dân [22] (hình 2).

5


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người
được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc
đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột
biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có
thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột
biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột
biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới
các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và
ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô

thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi
trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp.
Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại
oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị
thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ
enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, hoặc stress
oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và
protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố

7


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể
có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển
điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận
chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện
tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS,
làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa
protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Như vậy biến đổi của hệ gen ty
thể có liên quan đến bệnh ung thư [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã được xác
định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng
trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở
vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi
ADN ty thể đã được xác định trong ung thư. Các biến đổi này bao gồm: đột biến
điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty
thể.

ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, như mất đoạn 4977 bp, đã được xác định ở
ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và
cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%)
bệnh nhân ung thư dạ dày [17].

9


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Thêm đoạn
Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp)
trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ
dày [72]. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung
thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung
thư đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác
định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng
trứng [69]. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung
thư.
Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể
phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong
vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt
khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl
hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất
chức năng của ty thể [38].
1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG