I HC QUC GIA HÀ NI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
   NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
LUC

MỤC LỤC

BNG KÝ HIU VÀ CÁC CH VIT TT a
DANH MC CÁC BNG c
DANH MC CÁC HÌNH d
M U 1
Chng 1- TNG QUAN 3
1.1. TY TH 3
1.1.1. H genome ty th 3
t bin ADN ty th và bnh ty th 5
t bin ADN ty th và bnh ung th 7
1.2. UNG TH I TRC TRÀNG 10
1.2.1. Khái quát v ung th i trc tràng 10
1.2.2. Nguyên nhân gây ung th i trc tràng 11
1.2.3. Phân loi các dng ung th i trc tràng theo mô hc 12
1.2.4. Các phng pháp ch i trc tràng [20] 15
T BIN ADN TY TH VÀ BNH UNG TH I TRC TRÀNG 16
t bin gen tARN ca ADN ty th 17
a ADN ty th 19
1.3.3. Các phng pháp phát hit bin gen ty th giúp chnh 22
1.3.4. Tình hình nghiên cu  trong nc 24
CHNG 2: NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP 26
2.1. NGUYÊN LIU 26
i tng nghiên cu 26
2.1.2. Hóa cht 26
2.1.3. Thit b 27
2.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 28
2.2.1. Tách chit ADN tng s t mô 28







 i trc tràng 46




 59
KIN NGH 60
TÀI LIU THAM KHO 61
PH LC i
Ph lc 1. Danh sách bm lâm sàng i
Ph lc 2. Kt qu gii trình t n 10398 vi Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

a

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt
Viết đầy đủ
bp
Base pair (cp baz)

NADH dehydrogenase 3
PCR
Polymerase chain Reaction (Phn ng chui trùng hp)
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

b

RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
 n ct gii hn)
ROS
Reactive oxygen species (Các loi oxy phn ng)
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SNP

TBE
Tris borate EDTA
TNM
TumorNodeMetastasis

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

c DANH MỤC CÁC BẢNG



DANH MỤC CÁC HÌNH

 cu to ADN ty th i [ 75]. 4
Hình 2. Các bnn ri lon ADN ty th [64] 6
Hình 3. Genome ty th vt bin trong các b 8
Hình 4. Hình i trc tràng [76]. 11
n phát trin ci trc tràng [77]. 15
Hình 6. Mt s t bim trên tARN ty th i [59]. 17
Hình 7. ng s tách chit t mô 37
Hình 8. n di sn phn gen 3243 38
Hình 9. 3243 

 HaeIII 39
Hình 10. n di sn phn gen 10398 41
Hình 11. 10398 

 42
Hình 12. Kt qu gii trình t mt bin A10398G 43
Hình 13. Kt qu so sánh trình t mt bin vi trình t ADN
chun ca ty th 44
Hình 14. Kt qu gii trình t mt bin A10398G 44
Hình 15. Kt qu so sánh trình t mt bin vi trình t ADN chun ca ty
th 45
Hình 16. Bi phân b  theo v trí mô. 48
Hình 17. Bi phân b i tính. 49
Hình 18. Bi phân b i. 50
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________


c s quan tâm ca nhiu nhà khoa hc.
i trc tràng là mt trong các lo bin nht trên th
ging hàng th  qun  nam gi n gii.
Trên th gii có khong 3,5 triu bnh nhân mc b
khong hp mc phát hin [79].  Vii trc
m mt t l ng th hai v t l mc bnh cng
tiêu hóa, ch  dày.  c hiu qu u tr tt thì bnh
nhân cc chm càng tt. Vi s phát trin ca khoa hc, ngày
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

2

nay nghiên cu  m phân tu v t bin ADN ty th,
n vào công tác chu tr bnh có hiu qu.
Trong khuôn kh lu tài nghiên cu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng”
vi m
 Phát hin t bin gen tARN và ND 3  ADN ty th  bnh nhân
i trc tràng bng k thut PCR-RFLP.
 i liên 

t bin gen tARN và ND3  ADN ty
th vm lâm sàng ca 

i trc tràng  i
Vit Nam.
  c thc hin ti phòng Proteomics và Sinh hc cu trúc thuc
Phòng thí nghim Trm Công ngh Enzym và i hc Khoa

th [10] (1). Các chui polypeptide còn li cn thit cho cu trúc và ch
ca ty th c ghi mã bc tng hp trong ribosome ca
t bào cht.
Các nghiên cu trên ADN ty th cho thy h gen ty th có nh
riêng, phân bit vi h gen nhân. H gen ty th c tính di truyn theo dòng m,
có t n vài nghìn bn copy trong mt t bào. Các t bào khác nhau có s
ng bn copy khác nhau, tùy thuc vào nhu cng trong mô [60]. H
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

4

gen ty th không có vùng intron và các gen không có, hoc có rt ít các bazo không
mã hóa  gia chúng. Trong nhing hp không xut hin các codon kt thúc
mà ch có s polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nht trong h gen
ty th không tham gia mã hóa. Vùng D-c 1,1 kb cha các yu t
quan trng cho quá trình phiên mã và da promoter phiên mã ca
chui nng và chui nh, có vùng gn vi các yu t phiên mã ADN ty th
vùng D-Loop x  t bin s  ng ti tính toàn vn ca các chui
c mã hóa trong ty th [41]. Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75].
m ca h gen ty th hông có intron, không có histon bo v,
li phân b gn chuc t c to ra
  t bin ca ADN
ty th  nhân (khong 10 ln) [51]. Bi ADN ty th có nhiu bn sao nên
phân t b t bin có th cùng tn ti vi dng di (wild type) không b t bin,
to nên hi   ng nht (heteroplasmy). ADN ty th có th  dng
ng nht (homoplasmy) khi tt c các bn sao ca genome ty th   au.

6 Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]
t bin ADN ty th gây ra các bnh  i
c phát hin. Các bnh này có th xut hin  bt k n nào trong cuc
i, t a bé mng thành  mi la tui. Ngoài ra, nhit
bic di truyn theo dòng m, bi vy mà nhng chi có
th c dùng cho nhiu th h  [57]. Các nghiên cu cho tht
bin ADN ty th có liên qn tình trn kinh và tim mt
bin ty th gây bnh bao gt bit bin mn có liên quan ti
các bnh  i, hu ht trong s n h th
ngot s bnh có liên quan vt bin ADN ty th [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tt bim
gây bnh, tuy vy ch t bin gây bnh chính chim ti 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. C t biu  gen thuc phc h I ca chui hô
hp. Bnh tin trin cp, bán cp, mt th lc trung tâm dn ch giác
chung gim kèm chng lon màu sc.
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

7

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bnh gây ra bt
bin T8993G trên gen ATPasa 6 thuc phc h V. Ngi bnh có biu hin chm
phát trin, sc t võng mc, mt trí nh, mu hòa, yn kinh.
Hội chứng Leigh: Bt bin T8993G trên gen ATPasa 6,
ging vi bnh NARP, tuy nhiên bt bin th hin hi
chng i bnh có biu hin ri lon thoái hóa thn kinh tin trin, biu
hin su tiên ca tr, có t mt hoc nhiu khu vc ca

t b suy gim v ch n quá trình to thành ATP và ROS,
làm bin ði s biu hin ca mt s u hòa
protein và quá trình tng hp nucleotide ca t y bii ca h gen ty
th n b[27]. Mt s t bin ADN ty th c xác
nh trong nhiu loi un       i trc tràng, bung
trng, rut, gan, ty, tuyn tin lit, pht bin ADN ty th có th xut hin 
vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). n nay nhiu dng bii
ADN ty th nh trong ung i này bao gt bin
m, thêm hoc mt base, ln, mi s ng bn sao ADN ty
th. Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19]
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

9

Đột biến điểm
t bin ADN ty th  bi
trình t genome ty th trên 19 cng ca cùng bnh
y có 74% bt bit
bin thuc vùng D-loop, phn còn li (18,5%)   nh trong các gen 16S
rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong s t bit bin thêm hoc mt
base chim 42% thuc vùng D-Loop, còn lt bim thuc vùng ghi
mã và không ghi mã [55].
t bin ADN ty th c tìm thy  bnh i trc tràng. Polyak và
    t bin ADN ty th trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5,
[53].
Vi bng tr        t bin


i ta cho rng s ng bn sao ADN ty th trong b
ph thuc v trí ct bin trong b t bin trong
vùng D-u khin s nhân bn ADN ty th s làm gim s bn copy. Mt
t bin ADN ty th  các gen mã hóa cho các protein ca chui phosphoryl
hóa oxy hóa li có th  b m ng li s mt
cha ty th [38].
1.2. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Khái quát về ung thƣ đại trực tràng
i trc tràng hay còn gt kt (colon cancer) bao gm
i tràng là phn rut ln hình ch N bao
gn rut kn
xung (descending colon). Trc tràng (rectum) là phn rut th cha phân, ni
gii tràng và hu môn (hình 4). ng xy ra  n ni gii tràng
và trng hai lo  vi nhau và khó có th xác
y ra sau vì th c gi chung
i trc tràng [79].
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

11 Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76].
i trc tràng là mt trong nhng lo bin nht trên th
gii hin nay, chim t l cao th ng hc ch
 gii có khong 1 triu ca mc mi và trên na triu ca t
vong. T l mc bnh không gic tính t l bnh nhân  c phát
trin (M, Nht) cao gp 410 ln. Trên thc t, s ng
bnh nhân  c  già hóa dân s và

1.2.3. Phân loại các dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học
Theo phân loi mô hc ca T chc Y t th gii
trc tràng gm các dng: u tuyu mô, carcinoid (u ni tit bit hóa
u mô tuyn  carcinoid kt hp. Ngoài ra, mt s dng him gp
         ch máu, sacom m vi tn
ng khi ln), u hc t u mô t bào hình thoi (xut hin
riêng l hay kt hp vu mô tuyn hou mô vc
gu mô  u mô t bào sáng (xut hin riêng l hay
kt hp vi mt loi khác c   i tr    u mô v
thuTrong các dnu mô tuyn là dng rt hay gp, chim
n 95% trong tng s các di trt
phát t niêm mc rut vi tu có dng nt nh, g cao, khi có phát
sinh t mt u tuyn, biu hin ca n phát trin và
loi cng polyp hay dng nhú [7].
Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

13

Vin cc ca khi u và m
lan rng ca nó khi v t quan trt
nh liu pháp phù hp nh u tr n nay có mt s h thng phân
c s dng rng rãi trên th gii. S khác nhau gia các h
thng này ph thuc vào mch ca ti s dng trong vic ch
bnh án ca tng bnh nhân [20]. Trong khuôn kh lu cp
n h thng TNM (TumorLymph NodeM thng phân loi
c áp di vi các mu chúng tôi s dng trong nghiên cu.
H thi trc tràng dc, mc
 lan rng ca khn các hch bch huyt (Bng 1

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

14

N
x
 Hch bch huyc 
N
0
 ch bch huyt vùng
N
1
 n 3 hch bch huyt vùng
N
2
 n nhich bch huyt vùng
M – Di căn xa
M
x
 
M
0
 
M
1
 

i trc n (5) [29]:
 n 0, các t bào bc tìm thy trong các lp

M
0

100%
n I
T
12
N
0
M
0

8095%
n IIA
T
3
N
0
M
0

7275%
n IIB
T
4
N
0
M
0


07%

1.2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20]
Ngày nay, s phát trin không ngng ca khoa hc k thuc bit là các k
thut sinh hc phân t n cht, phát hin sm và theo dõi
hiu qu u tr i trnh này bao
gm:
Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

16

 Chẩn đoán lâm sàng có th da trên các triu chng: tiêu chy hoc táo bón,
có máu ln trong phân, phân cht, khó chu chung  b  ng hoc co
thng xuyên, st cân không rõ lý do.
 Chẩn đoán hình ảnh bin nht hii
tràng sigma bng ng soi mm giúp nhìn rõ các khi u và làm sinh thit.
 Chẩn đoán mô học và tế bào họct gia
các t bào bng, lon su mô ti ch. Ph bi là k
thut chc hút kim nh.
 Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Mt s các xét nghim ph
bin có th k ti là xét nghim sinh hóa phát hi
xét nghim máu trong phân (FOBT).
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Hiu nghiên cu phát hit bin ADN ty th  vùng mã
hóa và vùng không mã hóa (D-Loop)  b   i tr  
nt bin ADN ty th  các vùng mã hóa: ND1,
ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIIIrRNA 12S
và 16S [53].
Trong mt nghiên cu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cng