ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Như Quỳnh
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN
MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình,
những ý kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Đỗ Minh
Hà trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan
Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh,
bệnh viện K, Hà Nội; khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội; khoa
sàng lọc máu của Viện Huyết học và truyền máu Trung ương.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm công
nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên
và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 3 năm 2015
Học Viên Nguyễn Thị Như Quỳnh
2.2.7. Giải trình tự trực tiếp 28
2.2.8. Nhân dòng phân tử 28
2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê 32
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Kết quả phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh
nhân UTĐTT 33
3.1.1. Kết quả phân tích biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
33
3.1.2. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dòng 35
3.2. Kết quả phân tích biến đổi ADN của gen MMP-9 từ mẫu máu 42
3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi của promoter gen
MMP-9 42
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng promoter
gen MMP-9 43
3.3. Phân tích mối liên hệ giữa biến đổi C-1562T với một số đặc điểm bệnh
học của bệnh nhân UTĐTT 44
3.4. Phân tích biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình thường
50
KẾT LUẬN 53
KIẾN NGHỊ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 1
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng 3
Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT 9
2
Hình 20:Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo độ tuổi 47
Hình 21: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo giai đoạn TNM 48
Hình 22: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình
thường 50
3
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh
khác nhau 9
Bảng 2: Bảng phân loại các nhóm trong họ MMP (ở người) 11
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai
đoạn ung thư 14
Bảng 4 : Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 21
Bảng 5: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 22
Bảng 6: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 25
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR 25
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI 26
Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu bằng 29
Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector 29
Bảng 11: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9
31
Bảng 12: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi
pJet1.2 31
HNPCC Ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp - Hereditary
Non-Polyposis Colorectal Cancer
MMP Matrix Metalloproteinase
NK Giết tự nhiên – Nature killer
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction
RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - Restriction
Fragment Length Polymorphism
SDS Sodium dodecyl sulfate
TBE Tris-Borate-EDTA
TGF Yếu tố sinh trưởng kích thích chuyển dạng – Transforming
growth factor
TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase
UTĐTT Ung thư đại trực tràng
VEGF Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu – Vascular Endothelial Growth Factor
1
MỞ ĐẦU
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư phổ biến đứng đầu trong
các loại ung thư đường tiêu hóa tại các nước trên thế giới. Tại Việt Nam và các
nước châu Á, UTĐTT xếp thứ tư ở nam giới (sau ung thư gan, phổi và dạ dày) và
thứ ba ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung và ung thư vú). Từ năm 2007 đến 2011,
ở Việt Nam, chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, đã ghi nhận 3557 ca mắc
bệnh mới UTĐTT (chiếm 10,74% tổng số ca mắc bệnh ung thư) [52].
UTĐTT là một trong những loại ung thư có độ ác tính rất cao đồng nghĩa
với tỷ lệ tử vong cao. Tại Mỹ, năm 2013 ghi nhận tới 142820 ca UTĐTT mới
được chẩn đoán, trong đó có 50830 ca có khả năng dẫn đến tử vong sớm (chiếm
35,59% trường hợp mắc UTĐTT), năm 2014 thống kê có 136830 người mắc
UTĐTT mới và 50310 trường hợp tử vong (chiếm 36,77% trường hợp mắc
chức năng protein, do đó có thể tác động tới sự phát triển và di căn của tế bào
ung thư [18]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về những biến đổi vùng
promoter gen MMP-9 ở nhiều bệnh khác nhau trong đó có ung thư. Tuy nhiên ở
Việt Nam đến nay chưa có nghiên cứu nào về biến đổi vùng promoter gen MMP-
9 ở bệnh nhân UTĐTT. Chính vì những lý do như vậy, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở
bệnh nhân ung thư đại trực tràng”. Với mục đích:
- Xác định được biến đổi ADN trong vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở
một nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
- Đánh giá mối liên quan của những biến đổi ADN vùng promoter gen
MMP-9 với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt
Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu
trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư là một loại bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một
cách nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể.
Các tế bào bất thường này có thể xâm nhập vào các mô lân cận hoặc di chuyển
đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào mạch máu hoặc hệ bạch huyết.
Chúng sẽ tập trung lại và tiêu diệt các tế bào bình thường dẫn đến suy thoái chức
tãng sinh tế bào không ðýợc kiểm soát [54].
- Di truyền theo gia ðình: Khoảng 20% UTÐTT ðýợc cho là gây ra bởi ðột
biến gen di truyền. Hội chứng di truyền có liên quan ðến UTÐTT bao gồm: FAP
(đa polyp tuyến gia đình), AFAP là một kiểu nhẹ hơn FAP và HNPCC (UTĐTT
di truyền không do polyp). Những biến đổi này đa phần dẫn đến ung thư ở độ
tuổi còn rất trẻ [53].
- Ngoài ra còn có yếu tố dân tộc: Người Do Thái, người Mỹ gốc Phi có
nguy cơ mắc bệnh UTĐTT cao hơn các dân tộc khác [3].
1.1.2.2. Yếu tố không di truyền
- Chế độ dinh dưỡng: Các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu) và các loại thịt chế
biến (xúc xích, thịt hun khói, đồ hộp) có thể làm tăng nguy cơ ung thư đại trực
tràng. Nấu thịt ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể tạo ra các hóa chất độc hại
làm tăng nguy cơ ung thư. Còn chế độ ăn rau, trái cây và ngũ cốc nguyên hạt có
thể làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng [32].
- Vận động: Thói quen lười vận động có thể làm tăng nguy cơ ung thư [15,
26, 36]. 5
- Thừa cân: Tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ của việc
mắc và tử vong vì ung thư đại trực tràng [15].
- Hút thuốc: Những người hút thuốc trong thời gian dài cũng có nguy cơ
bị ung thư đại trực tràng cao hơn những người không hút thuốc. Hút thuốc cũng
làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư khác [33].
- Sử dụng rượu: Người sử dụng nhiều rượu có khả năng mắc UTĐTT cao
hơn những người không hoặc rất ít khi sử dụng rượu. Khoảng 15% các trường
hợp mắc UTĐTT là do sử dụng quá nhiều rượu [29].
- Bệnh tật: Những người có tiền sử mắc các bệnh đường ruột như viêm
ruột, viêm loét đại tràng; bệnh Crohn và đái tháo đường loại 2 cũng có nguy cơ
mắc bệnh UTĐTT cao hơn người bình thường. Trong các bệnh này, đại tràng
Chẩn đoán bằng mô học và tế bào học: Phương pháp này cho phép phân
biệt giữa các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phương
pháp này được coi là chuẩn vàng trong việc xác định UTĐTT, có ý nghĩa rất lớn
trong tiên lượng và điều trị bệnh.
Chẩn đoán phân tử: Đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và
giúp các bác sỹ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp. Hiện nay, chẩn đoán phân tử
thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến: PCR, Realtime PCR, FISH…
có thể phát hiện những bất thường ở các gen một cách chính xác.
Điều trị
Phẫu thuật UTĐTT: Phẫu thuật cắt đại tràng là phương pháp duy nhất
điều trị ung thư đại tràng ở giai đoạn sớm. Phương pháp phẫu thuật đại tràng qua
nội soi cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân một thời gian ngắn sau mổ
(ít đau) nhưng kết quả lâu dài của cắt đại tràng qua nội soi so với mổ mở thì vẫn
trong giai đoạn nghiên cứu. Trong hầu hết các trường hợp, bác sỹ sẽ phải nối lại
những phần còn lành của đại tràng. Khi không thể nối lại những phần còn lành,
cần phải thực hiện phẫu thuật mở thông đại tràng tạm thời hoặc vĩnh viễn.
Khoảng 15% bệnh nhân ung thư đại tràng cần phải mở thông đại tràng vĩnh viễn.
Hóa trị UTĐTT: Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng thuốc chống ung thư
để tiêu diệt tế bào ung thư. Hóa trị liệu có thể được sử dụng để tiêu diệt tất cả
những tế bào ung thư còn sót lại trong cơ thể sau phẫu thuật, để kiểm soát sự phát
triển của khối u hoặc để giảm bớt triệu chứng của bệnh. Nhược điểm của phương
pháp này là không chỉ nhằm vào các tế bào bệnh mà còn làm tổn thương đến mô,
tế bào lành như tế bào tủy xương. 7
Xạ trị UTĐTT: Xạ trị còn được gọi là phương pháp phóng xạ, sử dụng tia
X có năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư. Hạn chế của phương pháp này là
không áp dụng được khi ung thư đã lan ra toàn cơ thể. Biến chứng của phương
pháp này nhiều khi khá trầm trọng ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh,
ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối
u chưa ăn lan đến các cơ quan và mô lân cận.
- T4a: Ung thư đã phát triển xuyên qua thanh mạc.
- T4b: Ung thư đã phát triển xuyên qua thành ðại tràng, dính chặt hoặc
xâm lấn các mô và cõ quan kề cận.
N (Lympho node): Cho biết khối u đã lan đến các hạch bạch huyết và số
lượng hạch.
- Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết do thông tin
không đầy đủ.
- N0: Không có ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận.
- N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận.
- N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2 – 3 hạch bạch huyết kề
cận.
- N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các hạch
bạch huyết, nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết.
N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 – 6 hạch bạch huyết kề cận.
- N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 7 hạch bạch huyết kề cận trở
lên.
M (Metastases): Cho biết mức độ di căn của khối u
- M0: Không có di căn xa.
- M1a: Ung thư đã lan đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch bạch huyết
ở xa.
- M1b: Ung thư đã lan rộng đến từ 1 cơ quan xa trở lên hoặc một nhóm
các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã lan tràn đến các phần phúc mạc ở xa.
Tóm lại, UTĐTT được chia làm các giai đoạn:
- Giai ðoạn 0: Ung thý chỉ ðýợc tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của
ðại tràng hoặc trực tràng. Ung thý biểu mô tại chỗ là một tên khác cho
UTÐTT giai ðoạn này.
- Giai ðoạn I: Khối u ðã phát triển vào thành trong của ðại tràng hoặc
trực tràng. Khối u chýa phát triển výợt qua thành.
0
90
Giai đoạn II
A
T
3
N
0
M
0
84
Giai đoạn II
B
T
4
N
0
M
0
56
Giai đoạn III
A T
12
N
1
M
năng phân giải các protein của chất nền ngoại bào như collagen màng nền hay
lớp gian bào, proteoglycan, fibronectin, laminin, do đó chúng liên quan đến quy
trình tái tạo mô, quá trình phát triển phôi, mang thai, tăng trưởng và quá trình hồi
phục, chữa lành vết thương [40, 5]. Hoạt động của các MMP được kiểm soát bởi
các chất ức chế mô đặc hiệu TIMP (Tissue Inhibitors of Mettaloproteinase) hoặc
các chất ức chế mô không đặc hiệu cụ thể α2-macroglobulin. Sự phá vỡ cân bằng
MMP-TIMP có thể dẫn tới trạng thái bệnh lý như dạng thấp khớp, viêm xương
khớp, xơ vữa động mạch, tăng sinh khối u, di căn và chứng xơ hóa [5, 44].
Các MMP có thể được tự tổng hợp như một nội tiết tố hoặc được chuyển
đến từ ngoài màng dưới dạng proenzyme và quá trình hoạt động của chúng sẽ
được kích hoạt khi loại bỏ đầu N của một propeptide. Để giữ cho các enzyme này
ở dạng nghỉ, các phân tử Zn
2+
phải liên kết với một gốc cysteine tại trung tâm
hoạt động của enzyme. Liên kết này bị ảnh hưởng bởi một số tác nhân như tác
nhân chaotropic, sự phân cắt của các propeptide của các thành viên trong họ
MMP hoặc bởi các protease khác. Khi liên kết này bị phá vỡ, các MMP sẽ được
hoạt hóa và thực hiện một số chức năng của chúng trong cơ thể sống [45]. Họ
MMP bắt đầu đươc biết đến từ nghiên cứu của Gross và Lapière vào năm 1962,
khi họ nghiên cứu về những mảnh đuôi nòng nọc cấy trên môi trường gel có bổ
sung collagen, nhận thấy một loại enzyme đã phân giải collagen trong môi
trường nuôi cấy. Điều đó cho thấy trong thời gian biến thái, ở đuôi nòng nọc xuất
hiện một loại protease có khả năng phân giải collagen [46].
Hiện nay có tất cả 26 enzyme thuộc họ MMP (bảng 2) đã được tìm thấy
và chia thành 6 nhóm dựa vào cơ chất mà nó có thể phân giải, với vùng peptide
có chức năng và trình tự tương đồng [39]. Tuy nhiên không phải MMP nào cũng
được phát hiện ở người, ví dụ như MMP-18 chỉ được phát hiện ở loài Xenopus.
MMP-24 MT5-MMP Gelatin, fibronectin, laminin
MMP-25 MT6-MMP Gelatin
Các loại khác
MMP-12
Macrophage
metalloelastase
Elastin, fibronectin, Col IV
MMP-19
Aggrecan, elastin, fibrillin, Col IV,
gelatin
MMP-20 Enamelysin Aggrecan
MMP-21 XMMP Aggrecan
MMP-23 Gelatin, casein, fibronectin
MMP-27 CMMP Chýa rõ
MMP-28 Epilysin Chýa rõ 12
Hình 3: Cấu trúc các vùng của MMP [44]
1.2.2. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase
1.2.2.1. Vai trò của họ MMP đối với các quá trình trong cơ thể sống
Họ MMP tham gia vào rất nhiều quá trình trong cơ thể, cụ thể bao gồm:
Di cư tế bào: Sự hiện diện của các chất nền ngoại bào là chướng ngại cho
quá trình di cư của tế bào. Những tế bào bám trên chất nền ngoại bào khi muốn
chuyển từ vị trí này sang vị trí khác phải thay đổi từ kiểu bám dính sang kiểu di
động. Sự thay đổi yêu cầu cần một số quá trình: Sự hoạt hóa chức năng vận động
của khung tế bào, sự phân hóa thuận nghịch tại các vị trí bám dính, các phân tử
các cụm đa bào lớn. Khi di chuyển đến một diện tích nhất định, những tế bào này
tiết ra MMP-2. Hoạt động của MMP-2 ức chế sự di cư tế bào và giúp các tế bào
tổ chức thành cấu trúc ba chiều [7]. Ngoài ra, năm 1998, nghiên cứu của Fukuda
và cs đã cho thấy: Sự ức chế hoạt động của các MMP ở thận sẽ thúc đẩy sự phân
nhánh, còn ở tuyến nước bọt thì kìm hãm sự phân nhánh [14]. Như vậy, MMP
đóng một số vai trò khác nhau như: Thay đổi ECM, cho phép sự xâm lấn, lựa
chọn các điểm phân nhánh, tổ chức điều tiết ba chiều, điều tiết quá trình chuyển
đổi từ biểu mô tới trung mô.
Điều khiển các phân tử mang hoạt tính sinh học: Hoạt động của MMP
có thể dẫn đến sự hoạt hóa hay bất hoạt của các phân tử mang hoạt tính sinh học.
1.2.2.2. Vai trò của họ MMP trong sự tiến triển loại ung thư 14
Nghiên cứu ung thư cơ bản hiện nay phần lớn tập trung vào các đột biến
gen. Tuy nhiên, chất nền ngoại bào của khối u và các tế bào lân cận khối u, các tế
bào soma cũng có những ảnh hưởng nhất định trong sự tiến triển khối u. Khi đi
sâu nghiên cứu, các nhà khoa học nhận thấy rằng các MMP có thể thay đổi vi
môi trường xung quanh khối u và biểu hiện của các MMP ở các mô ung thư tăng
cao hơn so với ở mô bình thường.
Sáu dấu hiệu cơ bản trong sinh lý học tế bào làm nền tảng cho ung thư đó
là: Tự tạo ra các tín hiệu tăng trưởng, không đáp ứng các tín hiệu ức chế tăng
trưởng, thoát khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis), sự nhân rộng
không giới hạn, phát triển hệ mạch máu một cách bền vững, cuối cùng là cuộc
xâm lấn mô và di căn (bảng 3). Trước đây, các nhà khoa học chỉ tìm thấy ảnh
hưởng của các MMP trong giai đoạn xâm lấn và di căn. Nhưng những nghiên
cứu gần đây thì lại cho thấy rằng MMP cũng tham gia vào một số giai đoạn của
quá trình phát triển ung thư [16].
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai đoạn ung
thư [16]
XVIII
Giảm sự tăng sinh mạch máu
Kết dính tế bào và di cư
MMP-2 Phân hủy collagen loại IV Điều khiển di cư
MMP-2, -3, -9, -13, -14
Biểu hiện quá mức, có liên quan
tới EMT
Cảm ứng của EMT, Di cư tế bào
MMP-1, -7,
MMP-28
Hoạt hóa α-TGF phân giải
protein
Tác nhân gây cảm ứng mạnh mẽ
của EMT; di cư tế bào
Giám sát miễn dịch
MMP-9
Thay đổi thụ thể α-interleukin-2
trên bề mặt tế bào lympho T
Ngăn chặn các tế bào lympho T
tăng sinh
MMP-9, -2, -14 Thoát khỏi hoạt động của β-TGF
Ngăn chặn các tế bào lympho T
chống lại các tế bào ung thư
MMP-7, -11, -1, -8, -3
Thoát khỏi sự ức chế của α1-
proteinase
Giảm tính nhạy cảm của các tế
bào ung thư với tế bào NK
MMP-7, -8 Phân tách α- và β- chemokines Di cư bạch cầu
coli (Apc)
+ / Min-FCCC
(là những u tuyến đại trực tràng phát triển một cách tự
nhiên) thử nghiệm trên chuột đã xác định được 92% các u tuyến ruột đó, cho thấy
một tiềm năng trong việc sử dụng MMP-7 để phát hiện sớm UTĐTT [9].
Copyright: Tài liệu đại học ©