BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
……..***……..

NGUYỄN LÊ DUẨN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN
EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO
THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015
HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
…….***…….

NGUYỄN LÊ DUẨN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN
EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO
THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 8
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1 Tổng quan u não...................................................................................... 3
1.1.1 Tỷ lệ mắc u não ................................................................................. 3
1.1.2 Nguyên nhân gây u não .................................................................... 4
1.1.3 Phân loại u não .................................................................................. 4
1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) ............. 9
1.1.5 Triệu chứng lâm sàng ..................................................................... 10
1.1.6 Chẩn đoán cận lâm sàng ................................................................. 13
1.1.7 Điều trị u não .................................................................................. 15
1.2 Gen mã hóa EGFR và con đường khuếch đại tín hiệu ......................... 16
1.2.1 Gen mã hóa EGFR .......................................................................... 16
1.2.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR).................................... 17
1.2.3 Đột biến gen EGFR......................................................................... 19
1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến gen Glioblastoma . 20
1.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen – PCR và PCR lồng ................................ 20
1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen(Sequencing) .......................................... 25
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 27
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 27
2.1.1 Thời gian nghiên cứu ...................................................................... 27
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 27
2.2 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 27
2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu ............................................. 27


2.3.1 Thiết bị phòng nghiên cứu .............................................................. 27
2.3.2 Dụng cụ ........................................................................................... 28
2.3.3 Hóa chất sử dụng ............................................................................ 28
2.4 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 29
2.5 Quy trình kỹ thuật ................................................................................. 30

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

Tm

Melting temperature

A

Deoxyadenosine triphosphate

T

Thymidine triphosphate

G

Deoxyguanosine triphosphate

C

Deoxycytidine triphosphate

Kb


RNA

Ribonucleic Acid


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. U nguyên bào thần kinh đệm độ IV ............................................... 8
Hình 1.2. U nguyên bào thần kinh đệm độ IV trên tiêu bản mô bệnh học .... 9
Hình 1.3. Minh họa vị trí gen EGFR .............................................................. 16
Hình 1.4. Cấu trúc thụ thể phát triển biểu mô và sự hoạt hóa của EGFR ...... 17
Hình1.5. Con đường tín hiệu EGFR trong tế bào .......................................... 18
Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR .............................................. 22
Hình3.1. Minh họa đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch DNA trên máy Nanodrop.................................................................................................................. 38
Hình3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel 0,8% ..................... 40
Hình3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR exon 21 gen EGFR ........................ 40
Hình3.4. Kết quả giải trình tự exon 21 gen EGFR của bệnh nhân ................ 41


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các khối u của hệ thần kinh (WHO, 2000).................... 5
Bảng 2.1. Các thành phần phản ứng PCR vòng một khuếch đại exon 21gen
EGFR ............................................................................................................... 33
Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR vòng hai ....................................... 35
Bảng 2.3. Thành phần các chất trong mastermix giải trình tự gen................. 36
Bảng 3.1. Kết quả độ tinh sạch và nồng độ DNA sau tách chiết từ mẫu mô
của các đối tượng nghiên cứu.......................................................................... 39


1



cần thiết, hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng có thể phân loại, tiên lượng khả năng
mắc thể GB của bệnh nhân u não. Bên cạnh đó, trên thị trường đang phát triển
rất mạnh mẽ dòng thuốc ức chế ung thư qua EGFR đã được chứng minh hiệu
quả trên nhiều ung thư ở các cơ quan khác nhau liên quan đến đột biến gen
EGFR. Do đó, xác định đột biến gen còn hỗ trợ chỉ định điều trị đích với
trường hợp đột biến EGFR bằng cách kết hợp sử dụng thuốc ức chế EGFR
cùng các phương pháp điều trị khác.
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật tiên tiến để xác định đột biến gen như:
PCR–RFLP, giải trình tự gen, Scorpions ARMS, SMAP (Smart Amplification
Process). Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen hiện đang được sử dụng rất phổ
biến tại các phòng thí nghiệm; Scorpion ARMS đắt tiền và chưa được áp
dụng rộng rãi; SMAP còn đang trong quá trình thử nghiệm và hoàn thiện. Vì
vậy, trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định
đột biến gen EGFR, với giá thành dịch vụ rẻ và quy trình kỹ thuật không quá
phức tạp.
Với mục đích xây dựng quy trình xác định đột biến gen chính xác, phù
hợp với điều kiện bệnh nhân và kinh tế ở Việt Nam, nghiên cứu này được xây
dựng với mục tiêu:
1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến tại gen EGFR ở bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh đệm.
2. Bước đầu nghiên cứu xác định độ biến gen EGFR ở bệnh nhân u
nguyên bào thần kinh đệm.


3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan u não
1.1.1 Tỷ lệ mắc u não

nhiên nguyên nhân gây nên các khối u vẫn chưa được hiểu rõ. Nhiều nghiên
cứu đã chỉ ra một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh sinh u não:
- Yếu tố di truyền
- Hóa chất, phóng xạ
- Suy giảm miễn dịch
- Yếu tố gia đình
- Chủng tộc
- Tuổi
- Giới
1.1.3 Phân loại u não
1.1.3.1 Phân loại u não theo vị trí
Phân loại u theo vị trí được các bác sĩ quan tâm bởi nó giúp định hướng
chẩn đoán và điều trị.
Các u trên lều:
- Các khối u thùy não: u thùy trán, u thùy đỉnh, u thùy thía dương, u thùy
chẩm.
- Các khối u vùng trung tâm: u nhân xám trung ương, u não thất bên, u
thể trai, u hố yên, u não thất III, u tuyến tùng.
Các u dưới lều: bao gồm các khối u tiểu não, u góc cầu tiểu não, u thân não, u
não thất IV, u thùy giun.
Các vị trí khác: u lỗ bầu dục nằm ở khe giữa tầng trên lều và dưới lều, u lỗ
chẩm nằm giữa hố sau và ống sống [9].


5

1.1.3.2 Phân loại mô bệnh học u não


6



7

cơ quan tạo máu

U tương bào
Ung thư bạch cầu hạt

Các khối u tế bào U tế bào mầm
mầm

Ung thư biểu mô nguồn gốc phôi thai
U túi noãn hoàng
Ung thư nguyên bào nuôi
U quái
U tế bào mầm hỗn hợp

Các khối u vùng hố U sọ hầu
yên

U tế bào hạt

Các khối u di căn

U di căn từ các cơ quan khác như: ung thư
phổi, ung thứ vú, ung thư dạ dày …

1.1.3.3 Phân loại theo tính phổ biến của bệnh ( theo Osborn 1996)
a) U nguyên phát: chiếm 2/3 các khối u não

ý nghĩa trong tiên lượng và điều trị bệnh.
Theo cách phân loại này, các khối u tế bào hình sao của hệ thần kinh
được phân độ như sau:
- U tế bào hình sao thể lông: lành tính (độ I)
- U tế bào hình sao lan tỏa (độ II)
- U tế bào hình sao giảm biệt hóa (độ III)
- U nguyên bào thần kinh đệm: ác tính (độ IV) [12].


9

1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma)
Các tế bào của u nguyên bào thần kinh đệm được chia thành hai loại dựa
vào nguồn gốc phát sinh là u phôi thai tiên phát và u thứ phát từ tế bào hình sao.
Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá điển hình với
ranh giới hình vòng cung rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu xám hay hồng, có
điểm hoại tử màu vàng hoặc có màu nâu sẫm nếu có xuất huyết. Thành mạch
máu trong u tăng sinh dày. Có thể gặp u thể nang hay nhiều ổ, u thường có
mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dính vào màng não, gây chảy máu.

Hình 1.1: U nguyên bào thần kinh đệm độ IV
(Nguồn: studyblue.com).
Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất khác
nhau. Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với
nhiều giai đoạn trung gian giữa hai loại tế bào. Tính biệt hóa thấp, giảm thiểu
các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái.


10


và gây đau.
Triệu chứng hay gặp nữa trong u não là động kinh - dấu hiệu thần kinh
gợi ý nghĩ đến u não trong khoảng 40% trường hợp.
Liệt một dây thần kinh sọ nào đó, yếu tay chân, giảm trí nhớ hoặc thị
lực giảm cũng có thể gợi ý đến u não.
Nôn: là dấu hiệu của tăng tăng áp lực nội sọ. Nôn trong u não có đặc
điểm là nôn vọt, nôn không liên quan với bữa ăn, không có biểu hiện cơn đau
bụng trước nôn.
Phù gai thị: phù hoặc teo gai thị giác là triệu chứng khách quan khi tăng
tăng áp lực nội sọ sẽ đè ép vào các bó mạch của dây thần kinh thị giác dẫn
đến ứ máu tĩnh mạch và phù gai thị. Phù nề gai thị sẽ dẫn đến teo gai thị giác,
cho nên cần phải khám và phát hiện sớm hội chứng tăng tăng áp lực nội sọ để
tránh di chứng về mắt.
Rối loạn tâm thần: người bệnh thờ ơ, lãnh đạm, giảm trí nhớ, giảm tri
giác [15] [16].
Các triệu chứng chẩn đoán định khu:
a) U trên lều
- U thùy trán:


12

Giảm trí nhớ và biểu hiện rối loạn tâm thần thường gặp như: khoái cảm
châm chọc, cười không duyên cớ, đôi lúc thô bạo, có thể mất khứu giác và teo
dây thần kinh thị giác.
- U thùy đỉnh:
Biểu hiện đặc trưng của u thùy đỉnh là rối loạn cảm giác và rối loạn vận
động; giảm cảm giác, xúc giác, mất khả năng định vị vị trí không gian.
- U thùy thái dương:
Nếu u đè ép vào hồi móc sẽ gây nên ảo khứu, ảo thính và ảo thị, rối

Nếu có biểu hiện tê ở mặt và lưỡi là do u chèn ép vào dây V.
- U tiểu não:
Có thể gặp ở thùy giun hoặc ở bán cầu tiểu não.
Triệu chứng: đau đầu, xu hướng ngày một tăng hội chứng tăng áp lực
nội sọ rõ, buồn nôn và nôn; rối loạn dáng đi, đi không vững, lảo đảo do rối
loạn thăng bằng, người bệnh hay bị té ngã.
Ngoài ra còn có u các dây thần kinh sọ gồm các u dây thần kinh thị
giác, giao thoa thị giác, dây thần kinh thính giác [9] [10].
1.1.6 Chẩn đoán cận lâm sàng
Hiện nay, u não nói chung và GB nói riêng sử dụng các phương tiện
chẩn đoán cận lâm sàng là chẩn đoán hình ảnh và chẩn đoán mô bệnh học
- X quang hộp sọ
Chụp sọ có thể thấy hình ảnh tăng tăng áp lực nội sọ, các đường khớp
cách xa nhau, dấu ấn ngón tay. Ngoài ra có thể thấy hình ảnh biến đổi ở hố
yên như bào mòn hố yên và mất chất vôi do tăng tăng áp lực nội sọ lâu ngày.
Đối với u sọ hầu có thể thấy u bị ngấm vôi toàn bộ. Hình ảnh tiêu xương có
thể gặp trong u dây VIII làm cho lỗ tai trong rộng ra và thay đổi bờ trên
xương đá. Các u màng não cũng có thể ăn khuyết xương sọ.


14

- Điện não đồ
Đo điện não có thể phát hiện được những sóng chậm delta, bêta ở một
khu vực nào đó nếu kết hợp với các triệu chứng lâm sàng đúng đắn có thể
giúp ta chẩn đoán định khu của u não.
- Siêu âm
Siêu âm đường giữa, nếu có sự dịch chuyển của đường giữa từ 1-1,5cm
là có giá trị chẩn đoán. Siêu âm hai chiều hay còn gọi là siêu âm Doppler,
được áp dụng trong việc chẩn đoán bệnh não ở trẻ sơ sinh thóp còn hở,

tổ chức não lành. Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc
vào vị trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không. Liên quan với u, khối
lượng u và trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên. Nhờ chụp cắt lớp vi
tính và kính hiển vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn.
Tuy nhiên không phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng
não có giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần.
U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì
việc lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm
máu.
- Điều trị tia xạ
Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại
sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu
Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo. Người ta còn dùng để ngăn
không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma
tuyến yên hoặc Craniopharynoma. Nói chung trong những năm qua điều trị
các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của
trang thiết bị máy móc. Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não,
phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao.


16

- Điều trị hoá chất
Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ,
nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng. Người ta
khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát
triển nhanh, cụ thể đối với các loại Glioblastoma, Astrocytoma độ III và độ
IV. Nhiều tác giả đã cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị tốt hơn.
Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau:
Cyclophosphamide, 5 Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate (Aethopterin),

xuyên màng đặc hiệu nắm trong vùng phân cực của lớp phospholipid màng;
phần trong là protein của các Tyrosine, nơi xảy ra các phản ứng tự phosphoryl
hóa của EGFR [18] [19].