BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
-----***-----

VŨ ĐỨC ANH

Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của
gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Chuyên ngành : Hóa sinh y học
Mã số

: 62720401

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
TS. TRẦN HUY THỊNH

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời
cảm ơn chân thành tới:
TS.BS. Trần Huy Thịnh, Phó Trưởng Bộ môn Hoá sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người
Thầy đã trực tiếp chỉ bảo, tận tình truyền đạt những kiến
thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể

dưỡng và tình yêu thương của Cha Mẹ tôi, cũng như sự giúp
đỡ của các anh em trong gia đình, những người đã luôn ở
bên tôi, là chỗ dựa vững chắc cho tôi yên tâm học tập và
hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày
tháng

năm
Bác sỹ

nội trú

VŨ ĐỨC
ANH


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là: Vũ Đức Anh, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 Trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Thầy: TS.BS. Trần Huy Thịnh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở
nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về
những cam kết này.
Hà Nội, Ngày 16 tháng 9 năm
2017



IARC

International Agency for Research on Cancer
(Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế)
Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch
đại chuỗi gen).
Union for International Cancer Control (Liên
minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế )
World health organization (tổ chức y tế thế
giới).

PCR
UICC
WHO


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Khả năng di truyền của UNBVM...................................................
12
Bảng 1.2. Xác xuất proband mang đột biến gen RB1 ở tế bào mầm .............
12
Bảng

2.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR
........................................................................................................
35

Bảng


chiết
từ
máu
ngoại
vi
của
bệnh
nhân
........................................................................................................
44
Bảng 3.4. Bảng tổng hợp các đột biến tại exon 10, 14 và 20
........................................................................................................
50
Bảng 4.1. Các phương pháp xác định đột biến gen RB1


........................................................................................................
53
Bảng 4.2. Tỷ lệ phát hiện đột biến trên gen RB1 ở các bệnh nhân UNBVM
được báo cáo từ các quốc gia khác nhau
........................................................................................................
54

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đồng tử màu trắng trong UNBVM ................................................
10
Hình 1.2. Tế bào thủ phạm gây ra u nguyên bào võng mạc............................
19
Hình 1.3. Hình ảnh hiển vi điện tử UNBVM..................................................
19



11

ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào võng mạc (Retinoblastoma) là một trong những bệnh lý
ác tính thường gặp nhất trong ổ mắt ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh [1]. Dạng ung
thư này phát triển ở võng mạc mắt, tại các mô nhạy cảm đặc biệt với ánh
sáng, là những mô nhận biết ánh sáng và màu sắc phía sau của mắt, với tần
suất thường gặp từ 1/15.000-1/18.000 trẻ sơ sinh sống [1][2]. U nguyên bào
võng mạc (UNBVM) chỉ đứng hàng thứ hai sau u ác tính ở hắc mạc về tần
suất xuất hiện của các khối u trong ổ mắt [3]. Bệnh biểu hiện bệnh thường
rất sớm, độ tuổi trung bình được chẩn đoán là 18 tháng, UNBVM thể một
bên thường được chẩn đoán trên dưới 24 tháng và những trường hợp
UNBVM thể hai bên thậm chí thường được chẩn đoán trước 12 tháng [3].
Bệnh thường để lại nhiều biến chứng về mắt, phần lớn các trường hợp được
phát hiện muộn, khi bệnh đã lan rộng hay di căn, phải loại bỏ nhãn cầu, nạo
vét hốc mắt, làm mất thị lực và đe dọa đến tính mạng của trẻ. Nếu không tử
vong, xương mặt trẻ cũng bị biến dạng ảnh hưởng đến tinh thần và chất
lượng cuộc sống của trẻ. Chẩn đoán sớm và các phương thức điều trị mới
giúp cải thiện tiên lượng sống cho bệnh nhân UNBVM, lên tới 90% [2][5].
U nguyên bào võng mạc có liên quan tới đột biến gen RB1, hiếm hơn là
sự khuếch đại gen ung thư MYCN [4][7]. Gen RB1 là một gen ức chế khối
u có chức năng chính điều chỉnh chu kỳ tế bào, nằm ở nhánh dài nhiễm sắc
thể 13q14, dài 185 kb, gồm 27 exon mã hóa cho protein RB. Protein RB
điều chỉnh chu kỳ tế bào bằng cách hoạt động như một chất ức chế phiên
mã (nhắm vào mục tiêu là các yếu tố phiên mã E2F). Các tế bào phân chia
không thể xâm nhập vào giai đoạn S của phân bào và quá trình phân bào
không được diễn ra. Trẻ mắc UNBVM khi cả hai alen của gen RB1 bị bất
hoạt và protein RB bị mất hoàn toàn chức năng [4][7].

gen.


13
2. Đánh giá sự phân bố, tỷ lệ và các dạng đột biến trên một số exon

trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân u nguyên bào võng mạc.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm bệnh u nguyên bào võng mạc
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh u nguyên bào võng mạc
Năm 1657, Peter Pawlus Amsterdam lần đầu tiên mô tả lâm sàng và giải
phẫu bệnh UNBVM ở trẻ nhỏ có khối u được mô tả “là một chất tương tự
như mô não trộn lẫn với máu và giống như đá dăm” [10].
Năm 1805, William Hey báo cáo một bệnh án UNBVM hai bên mắt và
sử dụng thuật ngữ “mắt mèo mù”. Ông mô tả một khối u ảnh hưởng đến
toàn bộ nhãn cầu và phá hủy tổ chức nhãn cầu [11].
Năm 1809, một nhà phẫu thuật người Scotland tên là James Wardrop đã
viết một chuyên khảo, mô tả tập hợp con các ca lâm sàng về khối u sùi loét
phân biệt chúng với các trường hợp “ung thư mềm” khác, Sarcom tủy
xương, hoặc viêm. Ông là người đầu tiên phát hiện ra UNBVM như là một
khối u riêng lẻ, phát sinh ban đầu từ võng mạc [12].
Virchow vào năm 1864 đã sử dụng cái tên: u thần kinh đệm võng mạc
bởi vì có sự giống nhau giữa các khối UNBVM với các khối u thần kinh
đệm nội sọ. Verhoeff, năm 1922 đã quan sát nguồn gốc của võng mạc và sự
hiện diện của tính chất chưa trưởng thành, những tế bào chưa phát triển này
đã hình thành lên khối u và được gọi là UNBVM (Retinoblastoma). Năm
1926, hội nhãn khoa Mỹ đã chấp nhận thuật ngữ retinoblastoma và các
thuật ngữ cũ để mô tả UNBVM như: khối u thần kinh đệm võng mạc, các

Ở trẻ nhỏ có tiền sử gia đình, bệnh có thể phát hiện ở giai đoạn rất sớm
nhờ thăm khám đáy mặt sàng lọc khi mê. Ở những trẻ không có tiền sử gia
đình, dấu hiệu phổ biến đưa bệnh nhân đến khám là đồng tử trắng và lác.


15
- Đồng tử trắng hay dấu hiệu “phản xạ mắt mèo”, “mắt mèo mù” là dấu
hiệu kinh điển ánh phản chiếu màu trắng của khối u qua đồng tử.
- Lác là triệu chứng hay gặp thứ hai sau dấu hiệu đồng tử trắng.
- Dị sắc mống mắt cũng là một biểu hiện khá hay gặp, có thể do biến đổi
sắc tố nhưng thường là do tân mạch ở mống mắt gây ra mống mắt có màu
đỏ, khi tân mạch vỡ sẽ gây xuất huyết tiền phòng.
- Ít khi bệnh nhân được đưa đến vì một rung giật nhãn cầu hoặc nhãn
cầu phình dãn dạng mắt trâu.
- Với những trường hợp đến muộn thường có biểu hiện giả viêm như
mắt đỏ, giác mạc phù, giả mù tiền phòng, tăng nhãn áp, thậm chí là lồi mắt
hoặc u đã xuất ngoại vào hốc mắt.

Hình 1.3. Đồng tử màu trắng trong UNBVM
b) Cận lâm sàng
- Siêu âm: có thể phát hiện được hình ảnh khối u không đều, có âm vang
mạnh hơn dịch kính và có những chấm canxi hóa (giúp phân biệt khối u với
những tổn thương khác). Siêu âm có thể phát hiện được hiện tượng xâm lần
vào trong dịch kính hay ra ngoài vào khoang dưới võng mạc, khu trú vị trí
và đánh giá được kích thước khối u, tuy nhiên do độ phân giải kém nên
siêu âm không phân biệt được hiện tượng thâm nhiễm hắc mạc hay thị thần
kinh, vết canxi lớn cũng có thể gây trở ngại cho việc đánh giá đĩa thị.


16

17
+ Với những trường hợp đến muộn có thể có các triệu chứng như mắt
đỏ, giác mạc phù, giả mù tiền phòng, giả viêm màng bồ đào có nốt u hạt
hoặc lồi mắt.
- Cận lâm sàng:

+ Siêu âm, CT scanner, MRI: hình ảnh u nội nhãn, hình ảnh vôi hóa.
+ Giải phẫu bệnh có vai trò khẳng định chẩn đoán đánh giá nguy cơ
xấm lấn của khối u.
b) Chẩn đoán giai đoạn:
* Để đánh giá mức độ tiến triển của u người ta chia quá trình phát triển
của u thành nhiều giai đoạn. Theo Resse – Ellsworth phân chia UNBVM ra
làm 5 giai đoạn [29].
- Giai đoạn I: Một hoặc nhiều khối u dưới 4 đường kính gai thị ở
xích đạo hoặc sau xích đạo.
- Giai đoạn II: Một hoặc nhiều khối u có kích thước từ 4 – 10 đường
kính gai thị ở xích đạo hoặc sau xích đạo.
- Giai đoạn III: U đơn độc trên 10 đường kính gai thị ở sau xích đạo.
- Giai đoạn IV: Nhiều u rải rác, một số trên 10 đường kính gai thị,
mọi tổn thương lan ra trước tới vùng Ora Serrata.
- Giai đoạn V: U lan tỏa, chiếm hơn một nửa võng mạc. U xâm lấn
vào dịch kính.
* Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt Trung Ương thường sử dụng phân
loại của Knapp chia UNBVM làm 4 giai đoạn [4].
- Giai đoạn I: U còn nhỏ, khu trú ở võng mạc.
- Giai đoạn II: U đã to, xâm chiếm buồng dịch kính hoặc lan rộng ra
cả màng bồ đào, có thể tăng nhãn áp, thoái hóa mống mắt, kích thích phần
trước nhưng u vẫn còn trong nội nhãn.




19
* UNBVM thoái triển tự nhiên:
U nguyên bào võng mạc thoái triển tự nhiên được cho là xảy ra khi
một phần hoặc hoàn toàn khối u ác tính biến mất mà không cần điều trị
hoặc liệu pháp điều trị không đủ để gây ảnh hưởng đến khối u [34]. Bệnh
hiếm gặp, mỗi năm trên thế giới có khoảng 20 trường hợp được báo cáo
trong y văn [35],[36]. Cho đến nay cơ chế gây ra UNBVM thoái triển vẫn
chưa rõ ràng, có người cho rằng do hiện tượng miễn dịch hoặc do thiếu
máu tưới tổ chức u.
d) Chẩn đoán phân biệt: Cần phân biệt U nguyên bào võng mạc với
một số bệnh mắt trẻ em khác cũng có dấu hiệu đồng tử trắng
-

Bệnh Coats: những biến đổi mạch máu (giãn mạch) ở ngoại vi võng mạc,
dịch dưới võng mạc nhiều, không có can xi, thường ở hai mắt, không có
yếu tố di truyền.

-

Bệnh võng mạc trẻ đẻ non: gặp ở trẻ đẻ non có cân nặng khi sinh thấp và
được điều trị bổ sung oxy. Tăng sinh xơ mạch và bong võng mạc làm cho
đồng tử có màu trắng.

-

Tồn lưu tăng sinh dịch kính nguyên thủy: tăng sinh mạch và thần kinh đệm
trong dịch kính, nhãn cầu nhỏ, đục thể thủy tinh, các nếp thể bị bị kéo dài
ra (thấy rõ khi giãn đồng tử), glôcôm, bong võng mạc.


Nếu u còn nhỏ thì có thể điều trị bảo tồn bằng một trong các phương pháp:
Lạnh đông: chỉ định cho khối u nhỏ và ở phía trước. Quang đông hồ quang
xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định cho u nhỏ và ở phía sau. Tia
xạ: chiếu từ xa (chỉ định cho u lớn và ở phía sau) hoặc dùng tấm đồng vị
phóng xạ (thường dùng cobalt-60, iodine-125, ruthenium-106, và iridium192) cố định trên củng mạc tại vị trí khối u (chỉ định cho u kích thước trung
bình).

-

Liệu pháp hóa học: dùng cho những trường hợp đã di căn hoặc có nhiều
nguy cơ di căn toàn thân. Những thuốc thường dùng là Vincristine sulfate
(Oncovin), Doxorubicine (Adriamycin), Cyclophosphamite (Cytoxane),
Carboplatin (Paraplatin).
1.1.5. Đặc điểm di truyền, nguồn gốc tế bào U
nguyên bào võng mạc
a) Đặc điểm di truyền
Tư vấn về mặt di truyền của UNBVM sẽ cung cấp những
thông tin hữu ích cho bệnh nhân và gia đình về những đặc
điểm của bệnh, đặc tính về di truyền qua các thế hệ, nguy
cơ đối với các thành viên trong gia đình, và thậm chí có thể
gợi ý cho kế hoạch sinh con.
Cả hai alen của gen RB1 phải bị đột biến là điều kiện
hình thành nên khối UNBVM từ những tế bào võng mạc
đang phát triển. Tuy nhiên đột biến gen RB1 có đặc điểm


21
giống như là một gen trội, bởi vì các đột biến gen RB1 ở các
cá thể mang đột biến dị hợp tử sẽ luôn luôn “mất” alen thứ
hai và phát triển thành UNBVM [7], [22].

cả các tế bào của người bố hoặc mẹ bao gồm cả những tế
bào sinh sản. Kết quả là, các trường hợp di truyền thường bị
hai mắt và đa ổ, mặc dù một số trường hợp một mắt đã
được quan sát [7], [23].

Bảng 1.1. Khả năng di truyền của UNBVM [7]
Biểu hiện
lâm sàng ở
proband
Familial
Sporadic
bilateral

Sporadic
unilateral

%
bệnh
nhân
UNBVM
10%
30%

60%

Cơ chế di truyền
Thừa kế alen gen RB1 bị
đột biến
- 88% đột biến mới xuất
hiện trong tế bào mầm


Không
Có

(*) Đột biến khảm ở tế bào mầm chỉ tìm thấy ở nam giới (Sippel và
cộng sự 1998)


23
Bảng 1.2. Xác xuất proband mang đột biến gen RB1 ở
tế bào mầm [7]
Tiền sử gia
đình
Có
Không

Biểu hiện trên lâm sàng
Thể một mắt
Hai mắt
Đơn ổ
Đa ổ
+
+
+
+
+
+ (**)

Xác xuất
mang đột

Nghiên cứu cho thấy không có tế bào gốc ở võng mạc
Nơron hay tế bào thần kinh đệm đã biệt hóa
Nơ ron hay tế bào thần kinh đệm đã biệt hóa không thể tạo thành
UNBVM vì quá trình này chỉ xảy ra trong một thời gian rất ngắn của thời
kỳ bào thai trước khi võng mạc đã trưởng thành [7].
Tế bào mầm sinh ra võng mạc
Khả năng cao nhất là tế bào mầm ở võng mạc (Hình 1.4). Nghiên
cứu cho thấy: ở chuột, bất hoạt đồng thời RB và p107 cũng đều không sinh
ra UNBVM khi tế bào que đã trưởng thành. Nếu tiếp cận gây bất hoạt các
protein này bằng các phương pháp khác nhau khi các tế bào mầm đang tăng
sinh thì cách nào cũng đều phát sinh ra UNBVM. Khi dùng adenovi rút
mang gen sinh u E1A có khả năng ức chế protein RB sẽ gây rối loạn các tế
bào mầm võng mạc đang tăng sinh. Khi tách một tế bào mầm có mang E1A
ra, gây bất hoạt p53 và nuôi cấy riêng rẽ thì sẽ phát triển thành UNBVM.
Nghiên cứu cũng cho thấy gây bất hoạt protein RB1 ở võng mạc chuột
không có p107, tế bào mầm dễ bị phân bào lệch hướng hơn các tế bào đã
hoàn tất quá trình phân bào [7].
Tế bào vừa mới hoàn tất giai đoạn phân bào
Có một cách xác định tế bào nào là nguồn gốc là sử dụng marker biệt
hóa. Đó là tế bào có mang protein của khối u hay bộc lộ là tế bào thủ phạm.
- Phương pháp phân tích các markers biệt hóa: UNBVM biểu hiện
các gen đặc hiệu cho tế bào cảm quang ở võng mạc. Nhưng nghiên cứu cho
thấy khối u võng mạc người có biểu hiện nhiều markers tế bào đặc hiệu
khác. Điều đó có nghĩa là tế bào u xuất phát từ nhiều loại tế bào hay từ một
loại tế bào mầm mang nhiều markers khác nhau ở một thời điểm của quá
trình. Mất RB1 có thể gây ra nhiều thay đổi biểu hiện gen trong UNBVM,
phản ánh một chương trình phát triển tế bào bị rối loạn và không đặc hiệu.


25