BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY VỐI
(Cleistocalyx operculatus Roxb)
Khoa công nghệ sinh học
Chuyên ngành: vi sinh- sinh học phân tử
GVHD: Th.S Dương Nhật Linh
SVTH: Nguyễn Thị Thảo
MSSV: 1153010754
Niên Khóa: 2011- 2015

TP. Hồ Chí Minh ngày 05 tháng 5 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa
Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và
truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho đề tài nghiên cứu.
Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô Dương Nhật Linh đã tận
tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo
mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài
này.
Em xin chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh và những người anh,

Hình 3.5. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Escherichia coli…………………………..55
Hình 3.6. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Staphylococcus aureus…………………... 55
Hình 3.7. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng Samonella typhi………………………….. 56
Hình 3.8. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T. mentagrophytes……………….. 60
Hình 3.9. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm T. rubrum………………………... 61
Hình 3.10. Chủng vi khuẩn nội sinh kháng vi nấm M. gypseum…………………….. 61
Hình 3.11. Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết……………………….. 71
Hình 3.12. Khả năng kháng vi nấm gây bệnh của cao chiết…………………………. 75
Hình 3.13. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng methanol kháng vi khuẩn
gây bệnh……………………………………………………………………………... 78
Hình 3.14. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng ethanol kháng vi khuẩn
gây bệnh……………………………………………………………………………… 79
Hình 3.15. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng methanol kháng vi nấm
gây bệnh……………………………………………………………………………… 80
Hình 3.16. Kết quả MIC của mẫu cao chiết lá vối chiết bằng ethanol kháng vi nấm gây
bệnh…………………………………………………………………………………... 81

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

i


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Hàm lượng tinh dầu vối ở các địa phương của Nghệ An………………….. 8
Bảng 1.2. Thành phần hóa học tinh dầu vối………………………………………….. 8
Bảng 3.1. Kết quả quan sát đại thể,vi thể vi khuẩn nội sinh từ cây vối……………… 47

DANG MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết thu được từ lá….66
Biểu đồ 3.2. So sánh kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá vối………. 70
Biểu đồ 3.3. So sánh kết quả kháng nấm của các loại cao chiết từ lá vối………… 74

SVTH:NGUYỄN THỊ THẢO

iii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

One-way analysis of variance

CFU

Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cs

Cộng sự

DMSO

Dimethyl sulfoxid


Pseudomonas aeruginosa

PDA

Potato Dextrose Agar

S. aureus

Staphylococcus aureus

SDA

Sabouraud Dextrose Agar

SE

Standard Error

S. typhi

Salmonella typhi

TSA

Trypticase Soy Agar

T. rubrum

Trichophyton rubrum

1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI ..................... 14
1.3.1. Dermatophytes ....................................................................................................... 14
1.3.1.1. Microsporum gypseum ....................................................................................... 14
1.3.1.2. Microsporum canis ............................................................................................. 15
1.3.1.3. Trichophyton....................................................................................................... 16
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ................................... 17
1.4.1. Ngoài nước ............................................................................................................ 17
1.4.2. Trong nước ............................................................................................................ 17
1.5. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU .......................... 18

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

v


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC

1.5.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation)................................................................ 18
1.5.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) ............................................................... 19
1.5.3. Kỹ thuật chiết Sohxlet ......................................................................................... 20
1.5.4. Cô đặc và sấy khô ................................................................................................ 21
1.6. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
KHÁNG NẤM ................................................................................................................ 22
1.6.1 Phương pháp khuếch tán ....................................................................................... 22
1.6.1.1. Nguyên tắc ......................................................................................................... 22
1.6.1.2 Môi trường cơ bản thực hiện thử nghiệm........................................................... 22
1.6.1.3.


2.2.3. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh. ......................... 29
2.2.3.1. Chuẩn bị môi trường: ......................................................................................... 29
2.2.3.2. Chuẩn bị dịch vi sinh vật thử nghiệm ................................................................. 29
2.2.4. Định danh vi khuẩn nội sinh bằng thử nghiệm sinh hóa ..................................... 32
2.2.4.1 Nhuộm gram ........................................................................................................ 32
2.2.4.2. Thử nghiệm catalase.......................................................................................... 32
2.2.4.3. Indol ................................................................................................................... 32
2.2.4.4.Amylase................................................................................................................ 33
2.2.4.5. Nitrate ................................................................................................................. 33
2.2.4.6. Citrate ................................................................................................................ 34
2.2.4.7. Urease................................................................................................................. 35
2.2.4.8. Voges – Proskauer (VP) .................................................................................... 35
2.2.7.8. Các thử nghiệm lên men đường ....................................................................... 36
2.2.4.9. Phát triển ở 10% NaCl ....................................................................................... 36
2.2.4.10. Khả năng phát triển ở 50oC............................................................................ 36
2.2.4.11. Kiểm tra khả năng phát triển ở điều kiện kỵ khí ............................................ 37
2.2.4.12. Thủy phân casein ............................................................................................ 38
2.2.4.13. Xác định khả năng di động ............................................................................. 38
2.2.5. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá vối .................................................... 39
2.2.6. Định tính khả năng kháng khuẩn kháng nấm của cao chiết từ lá cây vối ............. 41
2.2.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn và vi nấm
gây bệnh........................................................................................................................... 42
2.2.7.1. Đối với vi khuẩn gây bệnh .................................................................................. 42

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

vii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


viii


ĐẶT VẤN ĐỀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm với nguồn dược liệu phong phú
và đa dạng. Theo thống kê Võ Văn Chi (1971) nước ta có khoảng 3200 loài cây thuốc
trong 10.000 loài thực vật ở Việt Nam.
Thuốc chữa bệnh là thành phần không thể thiếu được trong cuộc sống. Từ xa
xưa đến nay, con ngưới biết sử dụng cây cỏ vào việc điều trị bệnh. Mặc dù các loại
thuốc tây y chiếm một phần lớn trong phương pháp điều trị nhưng thuốc có nguồn
gốc thảo dược vẫn đứng một vị trí hết sức quan trọng (Võ Thị Mai Hương, 2012).
Một trong những hướng nghiên cứu mới hiện nay là tìm các hợp chất có nguồn
gốc từ thực vật có tác nhân kháng nấm, kháng khuẩn. Hiện nay cùng với sự phát triển
của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều. Bên
cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh thực vật có
khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn
chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các
loại nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs., 2008). Các loài thực vật này có trong tự
nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan
tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế
giới (Võ Thị Mai Hương, 2009).
Trong rất nhiều thực vật với mục đích chữa bệnh cây vối là một thảo dược an
toàn trong điều trị bệnh. Năm 2008, Kang và cộng sự, đã nghiên cứu và cho thấy tinh
dầu nụ vối (Cleistocalyx operculatus buds) chống lại tất cả các vi sinh vật thử nghiệm
bao gồm cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm Candida albicans với đường kính

từ cây vối.
 Định danh chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây vối.

SVTH: NGUYỄN THI THẢO

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

PHẦN I:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY VỐI (Cleistocalyx operculatus Roxb)
1.1. Giới thiệu chung về cây vối (Cleistocalyx operculatus Roxb).
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb, thuộc họ Myrtaceae.
Tên đồng nghĩa là Eugenia operculata Roxb.
Năm 1999, cây vối được Đỗ Tất Lợi mô tả và định danh là Cleistocalyx

cuống, dài 8-20 cm, hình trứng, rộng 5-10 cm. Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống
dài 1-1,5 cm. Hoa gần như không có cuống, màu lục trắng nhạt hợp thành cụm hoa hình
tháp toả ra ở những lá đã rụng. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 cm,
xù xì. Toàn lá, cành non, và nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối ( Võ Văn Chi
và cs, 1971).

SVTH: NHUYỄN THỊ THẢO

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Cây vối
1.1.2. Phân bố

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nụ vối

Vối khô

Hình 1.1 Hình cây và nụ vối

Cây vối được trồng và mọc hoang ở khắp các tỉnh nước ta, chủ yếu để lấy lá ủ nấu
nước uống. Cây vối còn được trồng, tìm thấy ở các khu vực, nước nhiệt đới châu Á,
Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi, 1999; Lê Trần Đức, 1997).
1.1.3. Công dụng của cây vối
Vối được trồng để lấy gỗ dùng trong xây dựng, làm công cụ, vỏ có chất dùng để
nhuộm đen. Quả vối ăn được (Lê Trần Đức, 1997).

1.1.4. Dược tính
Viện nghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tính chất kháng sinh của
lá và nụ cây vối đối với một số vi trùng Gram âm và Gram dương đã đi tới kết luận là ở
tất cả giai đoạn phát triển, lá và nụ cây vối đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông
kháng sinh tập trung nhiều nhất ở lá (Nguyễn Đức Minh, 1972).
Hoạt chất kháng sinh tan trong nước, các dung môi hữu cơ, vững bền với nhiệt độ
và ở các môi trường có pH từ 2 đến 9, mạnh nhất đối với Streptococcus sau đến vi trùng
bạch hầu và Staphylococcus và Pneumcoccus (Đỗ Tất Lợi, 1999).
Hợp chất flavonoid trong lá và nụ vối:


Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như

những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác
dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan,
tổn thương do bức xạ (Kang và cs, 2008)
 Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các
bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (Ye và
cs, 2004).

Đối tượng

Địa điểm

Hàm lượng (%)

Lá vối

Thành phố Vinh

0,10

Huyện Hưng Nguyên Tây

0,18

Nụ vối

Nghi Lộc

0,20

Hoa mới nở

Huyện Nam Đàn

0,21

Nụ hoa



Tên chất

Hoa vối

Nụ vối (%)

Hoa già (%)

Lá (%)

(%)
1

𝛼 − 𝑇ℎ𝑢𝑗𝑒𝑛

0,1

Vết

Vết

Không có

2

𝛼 − 𝑃𝑖𝑒𝑛

1,8


5

𝛽 − 𝑃𝑖𝑛𝑒𝑛

2,9

0,3

0,2

0,6

6

𝛽 − 𝑀𝑦𝑐𝑟𝑒𝑛

3,.3

35,1

38,0

24,6

7

p-Cymem

0,1


10

𝛽 − 𝐶𝑎𝑟𝑦𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙𝑒𝑛

5,3

4,6

4,2

14,5

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

11

Bergamoten

1,5

1,2

2,0


0,4

0,3

0,1

0,4

15

𝛽 − 𝑆𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒𝑛

0,8

0,4

Vết

0,1

16

Murenoen

Vết

Vết

Vết


12,0

13,3

32,5

32,1

20

Tecpinolen

0,1

Không có

Không có

Vết

Qua bảng 1.2, nhận thấy thành phần chính của tinh dầu vối là:
 β-myrcen 24,6 % (trong lá); 32,3 % (trong nụ hoa vối); 35,1 % (trong nụ); 38 %
(trong hoa già).
 (Z)-β-oxymen dao động từ 29,1 % (trong nụ hoa); 34,6 % (trong nụ); 32,5 %
(trong hoa già ; 32,1 % (trong lá).
 (E)-β-oxymen 12,0-13,3 % (trong nụ hoa); và 9,4 % (trong lá).
 β-caryophyllen 14,5 % (trong lá), cao hơn hẳn trong hoa và nụ (4,2-5,3 %).
 α-pinen dao động trong khoảng 1,8-3,7 %. Trong lá cao nhất là 3,7 %.
 Caryophyllen và α-humulen trong lá cao hơn trong hoa.


(C9H10O5)

2,4-dihidroxoxxyl-6-metoxi-3,5-

dimethylchacon (C18H18O8)

Axit oleanolic (C30H48O3)

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2. TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI
1.2.1. Escherichia coli
Phân loại như sau:
Phân ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Escherichia
Loài: Escherichia coli (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012).
E. coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 – 3 µm x 0,5 µm; trong
những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn
có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả
năng di động.
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tùy

Loài: Salmonella typhi (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012).
Khả năng gây bệnh của S. typhi:
Gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn. Bệnh thương hàn có thể gây
biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột. Một số biến chứng ít gặp hơn
như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008;
Lê Văn Phủng, 2012).

1.2.3. Staphylococcus aureus
Phân loại như sau:
Giới:Prokaryote
Phân ngành: Firmicute
Lớp: Firmibacteria
Họ: Micrococceae
Chi: Staphylococcus
Loài: Staphylococcus aureus
S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể
đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm
nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và
màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc
có vòng sáng rộng 2 – 5 mm.

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU


13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa:
Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như: khi cơ thể bị suy
giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính khi dùng corticoid lâu dài, hoặc khi sử
dụng kháng sinh tùy tiện… Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm
da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc.
P. aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp,
huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp.
Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi chúng gây
bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai
giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012).

1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI
1.3.1. Dermatophytes
Dermatophytes là nhóm nấm có quan hệ gần gũi với loại nấm có enzym karatinase
và có thể gây ra nhiễm trùng trong các mô keratin của người và động vật (da, tóc,
móng), dẫn đến một căn bệnh được gọi là dermatophytosis, thường được gọi là bệnh
nấm ngoài da. Nhóm này bao gồm chi Epidermophyton, Trichophyton và Microsporum,
có khoảng 40 loài. Tùy thuộc vào nguồn gốc của keratin được sử dụng, dematophytes có
thể được chia vào nhóm ưa đất (từ môi trường lây qua người qua vết trầy xước ở da),
nhóm ưu động vật (sống ở súc vật lây qua người) và nhóm ưa con người (chỉ gây bệnh
và lây trực tiếp người qua người). Đối với nhóm ưa đất, một số động vật và con người là
môi trường sống chính của chúng (Molina de Diego, 2011).
Bệnh nấm da thường được mang tên theo vị trí các phần khác nhau của cơ thể mà

+ Tiểu đính bào tử: hiếm.
Bệnh do nấm M. gypseum gây ra:
+ M. gypseum có thể sinh chốc đầu và hắc lào ở người và thú. Bệnh nhiễm nấm
do M. gypseum gây phản ứng mô rất mạnh ở kí chủ. Thường chỉ có một vết chốc
hay hắc lào.
+ Vi nấm khi xâm nhập tóc sinh ra những đám bào tử, mỗi bào tử có đường kính
khoảng 5- 8 µm, những bào tử này ở phần bao tóc (Molina de Diego, 2011).
1.3.1.2. Microsporum canis
Là nấm da thường gặp ở chó mèo, loài nấm này thường kí sinh trên lông ở vùng
đầu, chân, đuôi và một vài nơi khác của cơ thể. Trường hợp nặng vùng da bệnh trở nên
đỏ, chảy mủ. Sợi nấm sinh trưởng nhanh, bề mặt khuẩn lạc trắng tới vàng sẫm, mặt sau
màu vàng sáng hoặc màu vàng cam.
Quan sát hiển vi:
SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO

15