Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

ii

Lời cảm ơn

iii

Mục lục

iv

Danh mục những chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục biểu đồ

viii

Danh mục hình

ix



7

1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên

7

1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)

8

1.3.1. Phân loại

8

1.3.2. Hình thái, cấu trúc của PEDV

8

1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút

9

1.3.4. Dịch tễ học

10

1.3.5. Triệu chứng lâm sàng

12

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

18

2.3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

18

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

21

3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh

21

3.1.1. Kết quả điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

21

3.1.2. Tỷ lệ tử vong do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

29

3.1.3. Triệu chứng lâm sàng của bệnh

32

3.1.4. Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

51

Tai lieu chia se mien phi tai:v wWw.SinhHoc.edu.vn2


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

DNA

Axit deoxyribonucleic

ELISA

Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

EVD

Epidemic Viral Diarrhea

PED

Tên bảng

Trang

3.1

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi với độ tin

21

3.2

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

23

3.3

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Phù Cừ với
độ tin cậy 95%CI.

24

3.4

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

25

3.5


35

3.11 Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng RT-PCR theo loại mẫu

37

3.12 Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng RT-PCR theo lứa tuổi

39

3.13 Thông tin về các mẫu bệnh phẩm được sử dụng giải trình

41

3.14 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide của gene S của các chủng 43
3.15 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự acid amin của gene S của

45

Tai lieu chia se mien phi tai:vii wWw.SinhHoc.edu.vn4


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT

Tên biểu đồ

Trang


3.6

So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi của bệnh PED tại huyện
Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi và Văn Giang

29

3.7

Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED theo độ tuổi

30

3.8

Tỷ lệ tử vong do bệnh PED theo lứa tuổi của 4 huyện Tiên

32

3.9

Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

36

3.10 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR

38


3.1

Kết quả chẩn đoán virus PED bằng phản ứng RT-PCR. M: Marker

13

DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen). Giếng 1 – 8: 8 mẫu bệnh
phẩm khác nhau tương ứng là VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2,
VNUA/PED-HY3,VNUA/PED-HY4,

VNUA/PED-HY5,

VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 . Sản phẩm
PCR có kích thước là 651bp
3.2

41

So sánh trình tự nucleotide của gen S giữa các chủng virus PED
trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED tham
chiếu khác. Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự
nucleotide của chủng virus VNUA/PED-HY1

3.3

44

So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen S giữa các chủng virus
PED trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED
tham chiếu khác. Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid của

hóa, đem lại thu nhập chính cho ngành nông nghiệp.
Song song với sự phát triển đó, vấn đề về dịch bệnh diễn biến ngày càng
phức tạp làm ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của ngành chăn nuôi cũng như làm
thiệt hại về kinh tế.
Trong những năm gần đây “bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn” thường
xuyên xảy ra làm thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn do làm tăng chi
phí phòng, chống bệnh, thiệt hại về số lượng…
Bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae
gây ra. Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và
trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Ở Châu Âu Dịch PED xuất
hiện lần đầu tiên vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc
gia khác ở Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.
Ở Việt Nam, bệnh PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ
đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng

Tai lieu chia se mien phi tai:1 wWw.SinhHoc.edu.vn7


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước. Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do
virus PED gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vắc xin. Trong khi các chủng virus
thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc
nắm bắt và cập nhật được các đặc tính sinh học của các chủng virus PED đóng
vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vắc xin thích hợp và hiệu quả
phục vụ cho công tác tiêm phòng.
Để hạn chế dịch bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn do virus PED gây ra thì
việc nghiên cứu về dịch tễ học, và nghiên cứu được những đặc tính sinh học phân
tử của virus PED là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần
thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Cung cấp, hoàn thiện thêm các thông tin dịch tễ học về bệnh tiêu chảy
thành dịch ở lợn và đặc tính sinh học phân tử của virus.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài để đề xuất
các biện pháp phòng, chống phù hợp, từ đó khuyến cáo tới người chăn nuôi
cũng như chính quyền địa phương triển khai áp dụng các biện pháp đồng bộ
trong việc phòng, chống bệnh trên địa bàn tỉnh giúp cho ngành chăn nuôi phát
triển ổn định.

Tai lieu chia se mien phi tai:3 wWw.SinhHoc.edu.vn9


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Nước ngoài
Bệnh PED ở lợn lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971 do virus
PED gây ra. Ban đầu virus PED được gọi là EVD (Epidemic viral diarrhea) gây
bệnh trên lợn con, đặc biệt là lợn mới sinh, có tỉ lệ gây chết lên tới 100%. Đến
năm 1976, một phân type mới của virus EVD được phát hiện trên lợn ở mọi lứa
tuổi, được gọi là virus EVD type 2 để phân biệt với virus EVD type 1 ban đầu
(Wood, 1977). Năm 1978, Debouck và Pensaert đã phát hiện virus EVD type 2 là
một dạng giống với coronavirus (Debouck and Pensaert, 1980), cũng từ thời gian
này, dịch EVD được chuyển tên thành dịch PED.
Trong khoảng thời gian từ năm 1980 tới 1990, các ổ dịch liên tục được
phát hiện và xảy ra phổ biến ở các Quốc gia Châu Âu như Bỉ, Anh, Đức, Pháp,
Hà Lan, Thụy Sỹ. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các Quốc gia
Châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and
Park, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện

nhiên các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này
trong việc quyết định độc tính của PEDV. Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá
trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực
địa. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực
địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống
nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc
chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm
(Kusanagi et al., 1992). Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong việc phát hiện PEDV
như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử hoặc phản ứng ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay), tuy nhiên các kỹ thuật này tiêu tốn nhiều
thời gian và độ nhạy cũng như tính đặc hiệu thấp. Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên
phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được
phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí nghiệm và từ thực địa (Tobler and
Ackermann, 1995; Tobler and Ackermann, 1996). Để khẳng định sự có mặt của

Tai lieu chia se mien phi tai:5 wWw.SinhHoc.edu.vn11


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
PEDV trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen
M. Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản, đã có rất nhiều
những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplexRT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ
thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên
các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006).
RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu
dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản. Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi
được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng DNA đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn
so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra số lượng lớn hơn các
đoạn DNA (Ren and Li, 2011). Các kit phân tích Immunochromatography cũng được

tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã
gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích phát sinh loài,
thấy tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống
chủng ở Trung Quốc JS – 2004 – 2 (S.Puranaveja và cs, 2009).
1.2.2. Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam
Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy
ở Việt Nam (Nguồn: Báo Nông Nghiệp VN số 178 ra ngày 7/9/2011). Trong năm
2008 – 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh
hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn
lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử vong giữa các tỉnh dao
động từ 65 – 91%. Theo nhận định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu
chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày
ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra. Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số
trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009. Theo
thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu
năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là
Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền
Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi), ở các
tỉnh ở miền Bắc thì phòng xét nghiệm nhanh chỉ mới ghi nhận có một trại bị
nhiễm bệnh này thuộc tỉnh Thái Nguyên.
Nhìn chung, bệnh chủ yếu xảy ra ở khu vực Nam Bộ với những trận dịch
lớn, tuy nhiên ở khu vực phía Bắc cũng đã xuất hiện rải rác ở 1 số trại tại các tỉnh
Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang…
1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên
Trên địa bàn tỉnh Hưng Yên trong những năm gần đây bệnh vẫn xảy ra rải
rác, tập trung chủ yếu tại những địa phương có mật độ chăn nuôi lợn cao. Bệnh

Tai lieu chia se mien phi tai:7 wWw.SinhHoc.edu.vn13




Hình 1.1: Hình thái, cấu trúc của PEDV
Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012 (14)
1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút
- Đặc tính nuôi cấy trong môi trường tế bào: Ban đầu, việc nhân virus
PED được thực hiện bằng cách gây nhiễm cho lợn con theo đường miệng
(DeBouck và Pensaert, 1980), bằng cách cho lợn con uống virus. Việc nuôi cấy
virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn,
người ta đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công.
Phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học,
và công tác quản lý dịch bệnh.
Năm 1988, Hofmann và Wyler đã nghiên cứu thành công môi trường tế
bào thích hợp để PEDV phát triển, nhân lên và có thể phân lập được virus. Đến
nay, tế bào Vero (thận khỉ xanh châu Phi) có thể cấy chuyển được PEDV, gây
bệnh tích tế bào, tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của
men trypsin trong môi trường nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy, virus tác
động lên tế bào hình thành các không bào và thể hợp bào (có thể lên tới 100
nhân). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Ngoài ra, virus PED đã
được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở Nhật Bản
(Shibata và cs, 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P – 5V) đã được sử

Tai lieu chia se mien phi tai:9 wWw.SinhHoc.edu.vn15


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
dụng làm chủng virus vaccine và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6
và IB – RS2 (Kadoi K và cs,2002).
- Sức đề kháng: PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 40C và giữa pH 6.5 – 7.5
tại 370C, bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9. Trong môi trường nuôi cấy thích nghi,
virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 600C/30’, nhưng ổn định ở 500C.

Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa
các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa. PEDV có
thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy.
Khả năng lây lan sang người và sự tác động tới sức khỏe cộng đồng cho tới
nay chưa có công bố nào về sự lây truyền của PEDV sang người và các loài khác.
1.3.4.3.Cơ chế gây bệnh:
Cơ chế sinh bệnh của PEDV được nghiên cứu trên lợn con không được bú
sữa đầu. Cho lợn con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777, sau khoảng 22
– 36 giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy. PEDV nhân lên trong bào tương của các tế
bào lông nhung, phá hủy các tế bào biểu mô, làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột
và làm giảm hoạt động của enzym bề mặt biểu mô ruột. Tỷ lệ chiều cao và độ
dày của lông nhung thay đổi từ 7:1 xuống còn 3:1 (Utiger và cs, 1995; Porpischil
A, 1981). Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm với PEDV,
những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể quan sát được sau 12 – 18 giờ gây
nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 – 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá
hủy tế bào biểu mô ở kết tràng. Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của
lợn rất giống với TGEV. So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của
virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn.
Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được
nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát
thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc
được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh
nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào
được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng
cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành. (Nguyễn Văn Điệp và
Nguyễn Thị Lan, 2012).
Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch
huỳnh quang và kính hiển vi điện tử. Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy
sự nhân lên của virus ở các tế bào bên ngoài đường tiêu hóa. Shibata và cộng sự

rất khác nhau. Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc với tỷ lệ có thể lên tới
100%. Biểu hiện của PED tương tự TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có
tỷ lệ chết ở lợn con thấp hơn. Lợn con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước
sau khi tiêu chảy 2 – 4 ngày. Tỷ lệ chết ở lợn con trung bình khoảng 50%, nhưng
có thể cao hơn tới 100%. Ở giai đoạn lớn hơn, lợn thường tự hồi phục sau khi
quá trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần. Khi PED cấp tính ở 1 trại nào đó qua đi
thì lợn con giai đoạn 2 – 3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và
lợn mới nhập về thường phát bệnh. Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp

Tai lieu chia se mien phi tai:12wWw.SinhHoc.edu.vn18


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
tính điển hình với tỷ lệ chết cao trên lợn sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhưng
các ổ dịch tại Nhật Bản và Hàn Quốc lại cho thấy tỷ lệ lợn sơ sinh chết rất cao
(Sueyoshi M và cs, 1995; Chae C và cs, 2000).
Lợn trong giai đoạn vỗ béo: nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng
1 tuần tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy. Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi,
phân rất loãng, chứa nhiều nước. Biểu hiện lợn mắc PED trong giai đoạn vỗ béo
có thể nặng hơn so với mắc TGE. Lợn thường có biểu hiện đau vùng bụng nhiều
hơn. Sau khoảng 7 – 10 ngày, lợn sẽ hồi phục.Tỷ lệ tử vong lợn ở giai đoạn này
thường từ 1 -3%, lợn chết nhanh thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc
trước khi có biểu hiện tiêu chảy.Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại lợn có
giống mẫn cảm và chịu nhiều stress.
1.3.6. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể và vi thể của PED tương tự như bệnh TGE. Bệnh tích
thường tập trung ở đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non. Dạ dày thường trống
rỗng do lợn nôn và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng do sự kém hấp
thu ở ruột. Ruột non màu nhợt nhạt, chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng
tới mức có thể nhìn thấy được bên trong do sự teo lại của tầng niêm mạc.Chất

tin cậy.
Hiện nay, một số Kit ELISA được phát triển để xác định kháng nguyên
(PEDV) có trong phân của lợn và xác định sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh.
1.3.7.3. Chẩn đoán virus học
Sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction) để phân biệt hai virus gây bệnh PED và bệnh TGE.
1.3.7.4. Chẩn đoán phân biệt
Ngoài tiêu chảy do PEDV, có nhiều bệnh khác cũng gây ra triệu chứng tiêu
chảy, đó là phản ứng của cơ thể và hậu quả có liên quan đến đường ruột như:

Tai lieu chia se mien phi tai:14wWw.SinhHoc.edu.vn20


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
* Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (TGE-Transmissible Gastro Enteritis):
Nguyên nhân do virus thuộc họ Coronavirus, bệnh lây lan nhanh và tỷ lệ
chết của lợn con rất cao. Bệnh xảy ra ở lợn con dưới 2 tuần tuổi, lợn mất nước,
sút cân nhanh, nôn mửa, ỉa chảy phân nhiều nước, màu vàng hoặc hơi xanh, lổn
nhổn mùi khó chịu. Bệnh tích là thành ruột non mỏng, dạ dày chứa sữa không
tiêu màu trắng do TGEV phá hủy nhung mao ruột. Ở lợn trưởng thành bệnh ở thể
mang bệnh ít biểu hiện.
* Bệnh do Rotavirus:
Bệnh do virus thuộc họ Reoviridae gây ra, thường xảy ra ở lợn 1-5 ngày tuổi,
tỷ lệ chết cao 50 - 100%. Triệu chứng điển hình là phân nhão như hồ sau phân
lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất vón. Do virus cư trú,
hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng tiêu hóa và hấp thu
kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc và chậm lớn.
* Bệnh do E.coli (Colibaccillosis):
Sau khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa, vi khuẩn bám dính vào tế bào
nhung mao ruột non bằng các yếu tố bám dính. Tại đây vi khuẩn phát triển nhân



Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
Chương 2
NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu.
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trong những năm gần
đây trên địa bàn tỉnh Hưng Yên với các nội dung: lứa tuổi mắc bệnh, tỷ lệ chết,
triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể,…
- Khảo sát một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây bệnh PED trên
đàn lợn của tỉnh Hưng Yên.
2.2. Nguyên liệu.
- Đàn lợn được nuôi trên địa bàn tỉnh Hưng Yên.
- Số liệu điều tra tình hình bệnh PED theo phiếu điều tra một số ổ dịch tại
địa phương.
- Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu ruột và phân của
lợn nghi mắc bệnh PED.
- Trang thiết bị, dụng cụ cần thiết để mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm và các
trang thiết bị để sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử của mầm bệnh
như: Găng tay, khẩu trang, panh, kẹp, kéo, dao mổ, ống đựng mẫu, chày, cối, ống
Eppendorf, micropipette, máy li tâm, máy trộn, máy PCR System 9700, hóa chất
cần thiết khác,…
- Cặp mồi dùng trong chẩn đoán PEDV là cặp mồi P1/P2, trình tự cặp mồi
như sau:
Mồi xuôi/ngược

Trình tự mồi (5’ – 3’)

P1


đặc trưng của bệnh.
b) Phân tích số liệu
Dữ liệu thu thập được xử lý bằng phầm mềm Excel 2007.
2.4.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh
a) Lấy mẫu bệnh phẩm:
Mẫu bệnh phẩm là phân hoặc ruột của lợn nghi nhiễm bệnh tiêu chảy cấp
PED từ các trại lợn được thu thập bảo quản trong các ống chứa mẫu đã được vô
trùng. Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng cho phản ứng RT-PCR với các
cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh PED. Chỉ các mẫu dương tính với PEDV
mới được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
b) Phương pháp tách chiết RNA của PEDV từ các mẫu bệnh phẩm
Trizol (Invitrogen) được dùng để tách chiết RNA của PEDV, các bước được
tiến hành theo sự chỉ dẫn cụ thể theo hướng dẫn chuẩn của nhà sản xuất. Cụ thể, bổ
sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex và sau đó bổ sung
tiếp 200µl dung dịch Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút. Huyễn dịch trên được ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC.
Sau khi ly tâm, chuyển pha trên có chứa RNA vào một ống Eppendorf mới (với
lượng khoảng 500µl). Tủa RNA của virus bằng cách bổ sung 500µl dung dịch
Isopropanol, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Rửa tủa RNA bằng 1ml
dung dịch Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Hòa RNA
trong 30µl nước vô trùng đã loại Rnase và bảo quản ở -20oC.

Tai lieu chia se mien phi tai:18wWw.SinhHoc.edu.vn24


Tai lieu chia se mien phi tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
c) Phương pháp tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã
ngược (reverse transcriptase). Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ Kit
SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’. Thành phần