BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
--------------
NGUYỄN THỊ THANH NHÀN
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG
VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN
VIÊM DẠ DÀY TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH HẢI DƯƠNG
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Chuyên ngành:
Di truyền học
Mã số:
60.42.01.21
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phượng
PGS. TS Nguyễn Xuân Viết
HÀ NỘI, 2015
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Xuân Viết và TS. Lê Thị Phượng, người đã
hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
Cytotoxin - associated gene
Clarithromycin
Clarithromycinrithromycin
DNA
Deoxyribonucleic Acid
dNTP
Deoxynucleotitde
EDTA
Ethylen diamine tetraacetic acid
EtBr
Ethidium bromide
H. pylori
Helicobacter pylori
kb
Kilo basepais
Microgram
µl
Microliter
16S r RNA
16S ribsomal RNA
23S rRNA
23S ribsomal RNA
MỤC LỤC
PHẦN I - MỞ ĐẦU ......................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu. .................................................................................... 2
3. Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3
4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 3
PHẦN II - NỘI DUNG .................................................................................... 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI ...................................................... 4
1.1.1. Lịch sử phát hiện. .................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori........................................... 4
1.1.3. Đặc điểm di truyền của H. pylori ............................................................ 6
1.1.4. Dịch tễ học về H. pylori .......................................................................... 8
1.1.5. Cơ chế gây bệnh của H. pylori ................................................................ 8
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H. PYLORI ................................... 10
2.3.8. Phân tích và xử lý số liệu: ..................................................................... 33
2.3.8.1. Về các yếu tố dịch tễ học .................................................................... 33
2.3.8.2. Về xác định sự có mặt của H. pylori dựa trên số liệu gen 16S rRNA và
đột biến kháng thuốc trên gen 23S rRNA ........................................................ 34
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 35
3.1. PHÂN TÍCH DỊCH TỄ HỌC ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG BỆNH
NHÂN VIÊM DẠ DÀY ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA
TỈNH HẢI DƯƠNG. ...................................................................................... 35
3.1.1. Tuổi và giới tính .................................................................................... 35
3.1.2. Một số yếu tố dịch tễ khác và tỷ lệ người mắc bệnh dạ dày. ................ 37
3.2. PHÂN TÍCH GEN 16S RRNA CỦA H. PYLORI TRONG CHUẨN
ĐOÁN BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H. PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ
TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƯƠNG ................................................ 39
3.2.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA .................................................... 39
3.2.2. Xác định sự có mặt của H. pylori trên gen 16S rRNA ........................ 43
3.2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 16S rRNA ................... 43
3.2.2.2 Xác định sự có mặt của H. pylori bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA .......... 44
3.2.2.3. Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA .......................................... 45
3.2.3. Kết quả về tỷ lệ nhiễm H. pylori ........................................................... 46
3.2.4. Mối tương quan giữa yếu tố nguy cơ với tỷ lệ nhiễm H. pylori ........... 48
3.3. NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VI KHUẨN H. PYLORI KHÁNG
KHÁNG SINH Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H. PYLORI ĐANG
ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƯƠNG. ............................. 51
3.3.1. Xác định tính kháng kháng sinh bằng chỉ thị phân tử 23S rRNA .............. 51
3.3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 23S rARN ................... 51
3.3.1.2 Xác định đột biến kháng Clarithromycin và Amoxicillin trên gen 23S
rRNA ................................................................................................................ 51
3.3.1.3 Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA ......................................... 52
thuốc .................................................................................................. 55
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Vi khuẩn H. pylori ............................................................................ 5
Hình 1.2. Bản đồ di truyền của H. pylori. ......................................................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H. pylori .... 7
Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H. pylori.......................................................... 9
Hình 1.5: Mẫu thử CLO test ........................................................................... 10
Hình 1.6. Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn
Prokaryote và Archea (Woese et al 1987) ........................................ 13
Hình 3.1: Kết quả đo OD kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA .......... 42
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số được tách chiết từ mẫu bê ̣nh phẩ m ... 42
Hình 3.3. Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 16S rRNA .................... 45
Hình 3.4 : Kết quả đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA ...................................... 46
Hình 3.5. Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 23S rRNA .................... 52
Hình 3.6. Kết quả đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA .................................... 53
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Phân bố theo các nhóm tuổi ở bệnh nhân viêm dạ dày. ............. 36
Biểu đồ 3.2. Phân bố theo các nhóm công việc ở bệnh nhân viêm dạ dày ..... 38
Biểu đồ 3.3 : Tỷ lệ H. pylori âm tính và dương tính ....................................... 47
Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ đột biến tại vị trí A2143G và A2142C .............................. 54
PHẦN I - MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Viêm dạ dày là một bệnh lý tương đối rõ ràng, là hậu quả của sự kích
thích niêm mạc bởi các yếu tố ngoại sinh hoặc nội sinh. Viêm dạ dày chủ yếu
Nhật Bản và cao hơn một chút so với Hàn Quốc.
Các nghiên cứu nói trên được tiến hành chủ yếu ở các thành phố công
nghiệp lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh. Tại Hải Dương,
Helicobacter pylori được chẩn đoán là có trong dạ dày người bệnh dựa trên
hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy Helicobacter pylori từ dịch tiêu hóa, làm
test Urease để phát hiện Helicobacter pylori. Nuôi cấy Helicobacter pylori từ
mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tương đối dài và khi các vi khuẩn bội nhiễm
non - Helicobacter pylori đi kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn
hơn. Mặt khác, cho tới nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm
Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của Helicobacter pylori trên địa
bàn tỉnh Hải Dương. Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học hiện đại như
PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định
tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị
bệnh viêm dạ dày ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện
tuyến huyện tại Hải Dương là rất cần thiết trong việc nâng cao hiệu quả điều
trị bệnh, qua đó góp phần giảm tải cho các bệnh viện tuyến trung ương. Xuất
phát từ ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh
nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học
phân tử”.
2. Mục đích nghiên cứu.
2.1. Mục tiêu chung.
Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi
khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hướng kiểm soát và
điều trị hiệu quả căn bệnh này tại tỉnh Hải Dương.
2
2.2. Mục tiêu cụ thể.
1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI
1.1.1. Lịch sử phát hiện.
Từ hơn 100 năm trước đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự
hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó. Tiếp theo, nhiều nhà khoa
học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày
nhưng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn. Năm 1970, nhà giải phẫu bệnh
Robin Warren nhận xét có mối liên hệ giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại
xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày. Mãi đến năm 1982, Robin Warren và
người học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn từ
11 bệnh nhân bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh được những ảnh
hưởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày. Họ đã đặt tên cho vi
khuẩn này là Campylobacter pylori dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trưởng.
Năm 1983, phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó
với bệnh loét dạ dày tá tràng được công bố trên tạp chí Lancet. Năm 2005, với
phát hiện này, hai ông đã được trao tặng giải thưởng Nobel về y học [7].
Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trưởng của vi khuẩn mà người ta
đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori. Tuy nhiên dưới kính hiển vi điện
tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiêm mao khác hẳn.
Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hóa và cấu trúc chuỗi
RNA. Do đó hiện nay vi khuẩn được đặt lại là Helicobacter pylori [44,45].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori.
Về mặt sinh học, Helicobacter pylori (H. pylori) là vi khuẩn Gram âm
không tạo bào tử, có lông roi, một đầu được cấu tạo từ các sợi bao bọc bởi lớp
vỏ bên ngoài có tác dụng bảo vệ khỏi axít dạ dày. Dưới kính hiển vi, vi khuẩn
4
có hình xoắn cong, đường kính khoảng 0,3 - 1 µm, dài 1,5 -10 µm. Ngoài ra,
đôi khi cũng gặp H. pylori ở dạng hình cầu coccoid. Cấu trúc của vi khuẩn
tồn tại của nó trong môi trường acid dạ dày còn nhờ tác dụng bảo vệ của
enzym urease tạo ra môi trường kiềm xung quanh vi khuẩn. Trong điều kiện
không thuận lợi hoặc sau điều trị bằng một số kháng sinh H. pylori có thể gặp
ở dạng hình cầu và có thể chuyển thành dạng hoạt động [7]. Đây là dạng biến
thể kháng lại một phần chu trình sống của vi khuẩn và có vai trò quan trọng
trong việc lây truyền bệnh. Goodwin gọi đây là dạng “ngũ” và nhờ nó H.
pylori tồn tại lâu hơn ở môi trường bên ngoài trong điều kiện không thuận lợi.
Tạ Long và cộng sự nhận xét về đặc điểm siêu cấu trúc của H. pylori có thể ở
dạng hình cầu hoặc hình oval, một đầu có chùm lông được quan sát dưới kính
hiển vi điện tử [7].
1.1.3. Đặc điểm di truyền của H. pylori
H. pylori có kích thước genome bằng khoảng 1/3 kích thước genome của
E. coli và tương đương với genome của Haemophilus influenza. Genome của
H. pylori là một nhiễm sắc thể mạch vòng có kích thước khoảng 1,67 Mb,
gồm khoảng 1600 gen tổng hợp các protein tham gia vào quá trình trao đổi
chất của vi khuẩn. [38,42].
Hình 1.2. Bản đồ di truyền của H. pylori.
6
Sau khi giải mã toàn bộ trình tự genome của vi khuẩn, các nhà khoa học
nhận thấy các chủng H. pylori có thể mang các kiểu gen và các kiểu hình khác
nhau do đột biến. Khoảng 1% genome của chúng mã hoá cho 30 protein màng
ngoài, đóng vai trò quan trọng trong mối tương tác giữa vi khuẩn và các tế
bào biểu mô dạ dày. Các protein màng ngoài có thể sử dụng làm vắc-xin
phòng ngừa nhiễm H. pylori [26]
nguồn lây cho người.
- Nguồn lây từ môi trường, trong đó nước được coi là yếu tố quan trọng
nhất. Các nghiên cứu ở Chilê và Pêru đã chỉ ra nước và thực phẩm là nguyên
nhân chính trong việc lây nhiễm H. pylori.
- Nguồn lây từ người sang người: là đường lây phổ biến, nhất là trẻ em
và đặc biệt tại những nơi có điều kiện vệ sinh kém.
Một số yếu tố được coi là nguy cơ làm tăng tỉ lệ nhiễm H. pylori như
sống cùng nhau trong gia đình, trong các doanh trại quân đội, và một vài nghề
như bác sĩ nội soi [22].
1.1.5. Cơ chế gây bệnh của H. pylori
H. pylori có khả năng tiết urease mạnh, enzym này có hoạt tính rất mạnh
phân giải urê thành amoniac. Urê là sản phẩm chuyển hóa của các mô tế bào,
chúng vào máu một phần và được đào thải ra ngoài qua thận. Một lượng urê
8
tương đương từ máu qua lớp niêm mạc dạ dày vào dịch dạ dày. Amoniac có
phản ứng kiềm, tạo thành một lớp đệm bao quanh H. pylori, giúp cho chúng
tránh được môi trường axit cao của dạ dày. Mặt khác, amoniac sinh ra cũng
gây độc trực tiếp đối với tế bào niêm mạc dạ dày. Các enzym catalase, lipase
và glycoproteinase của H. pylori phân giải chất nhầy giúp cho chúng xâm
nhập vào niêm mạc sâu hơn và phơi bày các thụ thể tế bào cho các adhesin
của H. pylori gắn vào đó và dần dần phá huỷ tế bào. H. pylori còn tiết ra các
độc tố tế bào, các độc tố này cũng gây độc và phá huỷ tế bào [7].
Gần đây, người ta phát hiện thấy kháng nguyên CagA làm tăng tiết
interleukin-8, có giả thuyết cho rằng yếu tố này cũng là một trong các yếu tố
làm bệnh tiến triển đến ung thư [12,19].
Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H. pylori
khi được ủ ở 37 - 42oC, các test được đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy 7080%. Trong điều kiện hiện nay người ta thừa nhận ngưỡng phát hiện vi khuẩn
là 104 - 105 vi khuẩn/ml [22,35].
Ở Việt Nam thường sử dụng CLOtest (Campylobacter Like Organism
test) trong chuẩn đoán nhiễm H. pylori. Chẩn đoán nhiễm H. pylori bằng thử
nghiệm CLO test là một thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền, đơn giản và hữu
hiệu để phát hiện H. pylori. Độ nhạy và độ đặc hiệu khoảng 70-80 % và nếu
sinh thiết cả hai mẫu ở hang vị và thân vị thì độ nhạy sẽ tăng thêm 4,3% so
với chỉ lấy một mẫu ở hang vị [7].
Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dương tính trong loét tá tràng là 64,7%
đến 87,3% và trong loét dạ dày khoảng 60% [7].
Thực tế cho thấy, sử dụng test urea có thể cho kết quả âm tính do mật độ
vi khuẩn thấp hoặc dương tính giả do men urease của các vi khuẩn như
Enterobacter.sp và Pseudomonas.sp trong dạ dày làm cho thuốc thử chuyển
màu. Trong khi đó sử dụng các kỹ thuật phân tử sẽ không bỏ sót bất cứ trường
hợp nào bởi tính nhạy và tính đặc hiệu của các kỹ thuật phân tử rất cao.
1.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn H. pylori.
Trong chẩn đoán nhiễm H. pylori, phương pháp nuôi cấy cho biết mật độ
của H. pylori. Ngoài ra, còn cho biết dạng hình cầu của H. pylori là dạng hình
thái thoái hóa của vi khuẩn. H. Pylori phát triển tốt và phân lập được dễ dàng
trên môi trường thạch máu. Sau khi đã mọc thành khuẩn lạc, H. Pylori được
xác định nhờ các tính chất: vi khuẩn Gram âm, có các enzyme urease,
oxydase, catalase. Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phương pháp
này. H. pylori là loài vi khuẩn rất khó nuôi cấy ở điều kiện in vitro, nó cần môi
trường và khí trường đặc biệt khi nuôi cấy. Hơn nữa khuẩn lạc của H. pylori
trên môi trường đặc thường trong hoặc màu xám nhạt thường khó phân biệt,
11
đôi khi gây tan máu, đường kính của khuẩn lạc rất nhỏ khoảng 1 mm, xuất
Soule ( 1995)
105
98,4
Thijs (1996)
351
93
Lerang (1998)
104
100
Monterio ( 1999)
Tại Việt Nam kết quả nuôi cấy chẩn đoán nhiễm H. pylori thấp hơn so
với các thử nghiệm khác, nuôi cấy cho kết quả dương tính từ 36,8% đến
68,7% [1,7].
1.2.3. Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H. pylori
Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ
biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H. pylori. Theo một số kết
quả nghiên cứu thì PCR có độ nhạy khá cao. Mẫu bệnh phẩm có thể lấy từ
mẫu sinh thiết dạ dày, dịch hút dạ dày, mãng cao răng, nước bọt hay từ phân.
Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H. pylori trước điều trị, PCR còn dùng để theo
vừa phải cho phép phán đoán sự liên quan tiến hóa giữa các loài sinh vật. Cả
3 loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể
được chọn làm thước đo tiến hóa. Tuy nhiên, 5S rRNA có kích thước quá nhỏ
(khoảng 120 ribonucleotide), mang ít thông tin của quá trình tiến hóa nên ít
được lựa chọn nghiên cứu. 23S rRNA là phân tử lớn (có khoảng 2900
ribonucleotide), có đầy đủ các tính chất để có thể làm thước đo tiến hóa. Tuy
nhiên, kích thước của 23S rRNA lớn nên thao tác nghiên cứu trên phân tử này
không thuận lợi. Phân tử 16S rRNA có kích thước vừa phải, khoảng 1500
ribonucleotide, thuận lợi cho các thao tác nghiên cứu nên hiện nay, phân tử
này được coi như là “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do
những đòi hỏi cẩn trọng trong thao tác với rRNA bởi rRNA dễ bị phân hủy
nên sử dụng gen mã hóa cho rRNA thường là đối tượng phân tích trong các
nghiên cứu [26,34].
Trình tự gen 16S rRNA còn là một công cụ được sử dụng để định danh
vi khuẩn vì nhiều lý do.
- Đầu tiên, số liệu DNA của một sinh vật là đáng tin cậy hơn số liệu hình
thái trong nghiên cứu phân loại.
- Các gen 16S rRNA là tương đối ngắn, làm cho nó nhanh hơn và rẻ hơn,
nhưng lại đủ dài để có thể để xác định trình tự gen của vi khuẩn.
Gen 16S rRNA của các vi khuẩn có một điểm rất đặc biệt là có những
vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau
giữa các loài trong cùng nhóm. Tuy là những vùng biến động, nhưng những
vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở
các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên
14
của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối
quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Cho đến nay, số lượng các
2010) [10,15].
1.3.2. Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích
trình tự gen 23S RNA
1.3.2.1. Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H. pylori
Kể từ khi được phát hiện, đến nay kháng sinh đã được chỉ định trong
điều trị các bệnh của dạ dày tá tràng do H. pylori gây ra. Hơn 30 năm được sử
dụng trong lâm sàng, vấn đề tiệt trừ H. pylori đã đạt được rất nhiều thành
công [39,41]. Các kháng sinh được lựa chọn điều trị H. pylori phải thỏa mãn
được các yêu cầu sau:
- Nhạy với H. pylori
- Nồng độ kháng sinh trong dạ dày phụ thuộc vào pH của dạ dày, nên
nồng độ kháng sinh phải cao.
- Để tiêu diệt được vi khuẩn H. pylori kháng sinh phải vượt qua được
hàng rào chất nhày, đến với lớp biểu mô bề mặt nơi H. pylori cư trú. Hơn nữa,
kháng sinh phải tồn tại được thời gian dài đủ để tiêu diệt vi khuẩn. Trên cơ sở
này, mà các thuốc ức chế bơm proton, kháng sinh và bismuth là những thuốc
được lựa chọn đầu tiên. Trong đó, kháng sinh Clarithromycin, Amoxicillin,
Metrinidazole là những thuốc được ưu tiên chọn lựa [39,41].
1.3.2.2. Dịch tễ học của kháng kháng sinh
Sự đề kháng kháng sinh của H. pylori là yếu tố chính ảnh hưởng đến
hiệu quả của các phác đồ điều trị hiện dùng. Tỉ lệ loài vi khuẩn kháng thuốc
thay đổi tùy theo từng vùng địa lý khác nhau, và tương quan với mức sử dụng
kháng sinh trong dân số nói chung. Ví dụ, việc sử dụng clarithromycin và tỉ lệ
đề kháng kháng sinh này tăng tương tự nhau (gấp 4 lần) ở Nhật Bản trong
khoảng thời gian từ 1993 đến 2000 ( Perez Aldana Lvà cs, 2002) [40]. Trong
các tài liệu hướng dẫn của các nước châu Âu về điều trị H. pylori cũng
16
Copyright: Tài liệu đại học ©