BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NHỊ HÀ

TÌNH HÌNH NHIỄM NẤM XÂM NHẬP VÀ MỨC ĐỘ
ĐỀ KHÁNG THUỐC KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG NẤM
PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI TỪ 2013 ĐẾN 2017

Chuyên ngành

: Vi sinh

Mã số

: 62 72 01 15

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS PHẠM HỒNG NHUNG

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ quý giá của
những người mà tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc dưới đây.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Tiến sĩ Phạm Hồng Nhung, Phó trưởng
Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội, vì sự định hướng và tín nhiệm của Cô
trong quá trình học tập của tôi. Tôi cũng biết ơn Cô vì những lời khuyên quý báu, sự


Nguyễn Nhị Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT.........................................................................................2
DANH MỤC HÌNH ẢNH.......................................................................................3
DANH MỤC SƠ ĐỒ...............................................................................................3
ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
CHƯƠNG .1 TỔNG QUAN...................................................................................3
CHƯƠNG .2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP..............................................25
CHƯƠNG .3 KẾT QUẢ........................................................................................33
CHƯƠNG .4 BÀN LUẬN.....................................................................................48
KẾT LUẬN............................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................65


DANH MỤC VIẾT TẮT
CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute (Viện tiêu chuẩn
xét nghiệm và lâm sàng)

CT80

Cornmeal-Tween 80 (Thạch bột ngô – Tween 80)

SDA

Sabouraud dextrose agar (Thạch sabouraud dextrose)

bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực...................................................................44
g.Phân bố của các loài Candida gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được theo
bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực*.................................................................45
h.Tỉ lệ chủng nhạy cảm/chủng hoang dại theo loài Candida tại bệnh viện Bạch
Mai từ 1/2013 đến 6/2017......................................................................................47


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
i.Tỷ lệ nấm trên tổng số chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập
được tại bệnh viện Bạch Mai theo năm từ 1/2013 đến 6/2017............................33
................................................................................................................................ 34
ii.Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây bệnh
phân lập được theo bệnh phẩm............................................................................34
iii.Phân bố các loài Candida thường gặp từ bệnh phẩm máu theo thời gian (n =
356)......................................................................................................................... 37
iv.Phân bố các loài Candida thường gặp từ bệnh phẩm nước tiểu theo thời gian
................................................................................................................................ 38
v.Phân bố các loài Candida thường gặp phân lập từ bệnh phẩm dịch vô trùng
từ 1/2013 đến 6/2017 (n = 141)..............................................................................39
vi.Tỷ lệ nấm trên tổng số chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng xâm nhập phân
lập được tại một số khoa của bệnh viện Bạch Mai..............................................41
vii.Tỷ lệ nấm gây nhiễm trùng xâm nhập trên tổng số căn nguyên gây bệnh
phân lập được theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực..................................42
viii.Phân bố các loài Aspergillus gây nhiễm trùng xâm nhập phân lập được
theo bệnh phẩm tại khoa Hồi sức tích cực (n = 106)...........................................46


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

“Tình hình nhiễm nấm xâm nhập và mức độ kháng thuốc kháng nấm của các
chủng nấm phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017” với hai
mục tiêu:
1. Mô tả tình hình nhiễm nấm xâm nhập tại bệnh viện Bạch Mai từ
2013 đến 2017.
2. Xác định mức độ đề kháng thuốc kháng nấm của các chủng nấm
men phân lập được tại bệnh viện Bạch Mai từ 2013 đến 2017.


3

CHƯƠNG .1 TỔNG QUAN
.1.1.

Đại cương về nấm

.1.1.1.

Đặc điểm chung của nấm

Nấm, thuộc Giới nấm, là sinh vật đơn bào hoặc đa bào, có nhân thực; thành
tế bào cấu tạo chủ yếu từ chitin và glucan; sống dị dưỡng; sinh sản bằng bào tử [14].
Nấm sinh sản nhanh và dễ dàng phát triển trong mọi mọi môi trường, ngay
cả môi trường hầu như không có chất dinh dưỡng. Chỉ cần một phần tử sinh sản là
bào tử, nấm cũng có thể phát triển thành một quần thể rất nhiều nấm gọi là khuẩn
lạc nấm [14]. Nấm có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 1 - 37 0C, nhiệt độ phát triển
tối ưu từ 25 – 350C và phát triển mạnh khi độ ẩm môi trường cao (>70%) [15]. Mặt
khác, do không quang hợp, nấm phát triển không cần ánh sáng mặt trời [14]. Do đó,
nấm ở khắp nơi và trên cơ thể vật chủ, nấm có thể xâm nhập vào tất cả các cơ quan,
tổ chức từ nông đến sâu.

-

Lớp
Zygomycetes
Basidiomycetes
Arachiascomycetes
Hemiascomycetes

Nấm men: có cấu tạo đơn bào, hình cầu hoặc trái xoan, kích thước 3 – 15µm.
Khuẩn lạc thường nhẵn, giống khuẩn lạc của vi khuẩn. Ví dụ: Candida spp.

-

Nấm sợi: gồm những sợi nấm có cấu tạo đa bào, gồm những sợi có nhánh
dài, rõ rệt, tế bào có nhiều nhân. Nấm sợi được chia thành 2 loại:


4

o Nấm sợi có vách ngăn: tế bào được chia bởi các vách ngang hoàn toàn
hoặc không hoàn toàn, mỗi tế bào chứa 1 hay nhiều nhân.
o Nấm sợi không có vách ngăn bao gồm: Rhizopus và Absidia.
-

Hiện tượng lưỡng hình: hình thể nấm thay đổi tùy theo điều kiện môi trường.
Talaromyces marneffei, Histoplasma capsulatum… khi ký sinh hoặc nuôi
cấy ở 370C có dạng men, khi hoại sinh hoặc ở nhiệt độ phòng có dạng sợi.

.1.1.3.
-

o Gây nhiễm trùng đặc biệt là ở những đối tượng suy giảm miễn dịch,
có độc lực cao ở những người bị bệnh bạch cầu hoặc ung thư khác.
Cũng có thể tìm thấy C. tropicalis mà không có triệu chứng của bệnh.

(a) Khuẩn lạc trên CAN2

-

(b) Bào tử và sợi nấm trên CT80

(c) Nhuộm Gram

Hình 1.2 Một số hình ảnh về Candida tropicalis
Phức hợp Candida parapsilosis:
o Tế bào nấm men dạng trứng (2,5-4x3-8µm). Trên CT80 (25 0C, 72
giờ) các bào tử trần đứng riêng lẻ hoặc thành cụm nhỏ dọc sợi nấm
giả ngắn, cong hoặc gấp khúc.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc dạng kem.
o Gây nhiễm trùng ở những đối tượng đặc biệt nhạy cảm như trẻ sơ
sinh, người bị tổn thương hệ miễn dịch, điều trị kháng sinh,
corticosteroid hoặc các thuốc gây độc tế bào kéo dài, đặt catheter nội
mạch, mắc đái tháo đường hoặc tiêm chích ma tuý.

(a) Bào tử và sợi nấm trên CT80

(b) Nhuộm Gram

Hình 1.3. Một số hình ảnh về Candida parapsilosis
- Candida glabrata (trước đây là Torulopsis glabrata)
o Trên CT80 (250C, 72 giờ) tế bào nấm men nhỏ, bầu dục (2-3x3-4 µm)

(b) Tế bào nấm men trên CT80

(c) Nhuộm Gram

Hình 1.5. Một số hình ảnh của Cryptococcus neoformans
- Aspergillus fumigatus:
o Sợi có vách; cuống bào đài nhẵn, ngắn (300x5–10µm). Cuống bào tử
xếp sát nhau ở 2/3 trên bào đài, đối xứng qua cuống bào đài. Bào tử
tròn, nhẵn hoặc hơi xù xì, đường kính 2–3,5 µm.
o Mọc nhanh trong 3 ngày. Bề mặt khuẩn lạc mịn như nhung hoặc có
bột, màu sắc thay đổi từ xanh lá cây có viền trắng hẹp lúc mới mọc
sang xám nhạt khi già. Bề mặt màu từ trắng tới nâu.
o Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là căn nguyên thường gặp nhất của dị
ứng Aspergillus, Aspergillus xâm nhập (IA) và viêm xoang do nấm.

(a) Khuẩn lạc

(b) Bào tử nhuộm lactophenol cotton blue

Hình 1.6. Một số hình ảnh của Aspergillus fumigatus
- Aspergillus flavus
o Sợi có vách; cuống bào đài dài (400–800x8–18µm), xù xì điển hình;
chúng xòe ra thưa thớt, có thể tập hợp lại thành các cột bào tử khi già.
Bào tử đường kính 3–6µm với vách nhẵn hoặc hơi xù xì.


8

o Mọc nhanh trong 3 ngày. Khuẩn lạc mịn, bề mặt thường vàng nhạt tới
nâu, nhiều bụi vàng; có thể có viền trắng..

(c) Khuẩn lạc trên SDA (250C)

.1.2.

(d) Bảo tử nhuộm bằng lactophenol cotton blue

Hình 1.8. Một số hình ảnh của Talaromyces marneffei
Chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

.1.2.1.

Khái niệm nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh do nấm có thể được phân loại dựa trên vị trí nhiễm nấm: nấm bề mặt,
nấm da, nấm dưới da và nấm sâu (hay nấm xâm nhập). Nấm bề mặt, nấm da và nấm
dưới da gây tổn thương chủ yếu trên bề mặt, da và dưới da, chủ yếu gây cảm giác
khó chịu, giảm tính thẩm mĩ dẫn đến làm giảm chất lượng sống. Trong khi đó, nấm
xâm nhập gây nhiễm các cơ quan nội tạng như phổi, thận, lách, màng bụng, xương
và hoặc hệ thần kinh trung ương, và có thể gây rối loạn chức năng sinh lý của các
cơ quan nội tạng, thậm chí đe dọa tính mạng bệnh nhân.
.1.2.2.

Triệu chứng lâm sàng nhiễm nấm xâm nhập

Bệnh nấm xâm nhập là tình trạng bệnh do nhiễm nấm xâm nhập. Bệnh nhân
có thể sốt, mạch nhanh, nhiễm độc cấp tính hoặc mạn tính. Tuy nhiên, các triệu
chứng này không điển hình, khó phân biệt với nhiễm vi khuẩn. Các triệu chứng tại
chỗ thay đổi, tùy thuộc căn nguyên và đáp ứng miễn dịch của người bệnh [18]. Do
đó, việc khám lâm sàng có giá trị định hướng để chỉ định các xét nghiệm phù hợp.
.1.2.3.

hiện sự có mặt của nấm bằng soi trực tiếp. Phổ biến nhất là soi bệnh phẩm trong
KOH 10–20% chứa thuốc nhuộm huỳnh quang Calcofluor trắng, nhuộm Gram,
Giemsa, Periodic Acid Schiff, hoặc phối hợp các phương pháp nhuộm trên.
Test mực tàu có giá trị chẩn đoán xác định C. neoformans. Nhuộm Gram có
giá trị phát hiện Candida spp., Cryptococcus spp. và các phần tử sợi của nấm sợi
như Aspergillus, các loài thuộc chi Zygomycetes, và Fusarium spp. Điển hình nấm
bắt màu Gram dương nhưng có thể bắt màu không đều hoặc Gram âm.

Hình 1.9. Test mực tàu dương tính với Cryptococcus neoformans
Tuy nhiên độ nhạy của nhuộm soi còn thấp (nhuộm Gram độ nhạy là 54 –
73%, nhuộm Giemsa độ nhạy là 54 – 75%) nên vẫn bỏ sót căn nguyên gây bệnh.
-

Nuôi cấy phân lập và định danh
Hầu hết các trường hợp cần nuôi cấy để định danh căn nguyên gây bệnh và

đánh giá độ nhạy cảm in vitro với các loại thuốc kháng nấm, nếu có chỉ định.


11

Bệnh phẩm được cấy vào môi trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 300C theo dõi
hàng ngày. Hình thái trên kính hiển vi, đặc điểm ở môi trường nuôi cấy, màu sắc,
tốc độ phát triển và sắc tố là đặc điểm để nhận định sơ bộ loài nấm.
Phương pháp cấy kinh điển có nhược điểm là đòi hỏi thời gian dài hơn so với
vi khuẩn. Nấm có thể mọc sau 2 – 3 ngày. Một số loài nấm cần 5 – 7 ngày, thậm chí
tới 4 – 6 tuần. Có nhiều loại nấm khó nuôi cấy hoặc chưa nuôi cấy được.
Phiên giải kết quả cấy nấm khó do chúng thuộc vi hệ của một số vị trí trên cơ
thể (như đường hô hấp, dạ dày ruột và sinh dục tiết niệu) và bệnh phẩm hoặc môi
trường nuôi cấy có thể nhiễm các loài nấm có khả năng gây bệnh cơ hội trong môi

trường hoặc chủng nên đặc điểm này không thể dùng làm tiêu chuẩn định danh đơn
độc. Kết cấu bề mặt, hình thể, màu sắc, sắc tố mặt dưới, mọc ở 370C, và nhu cầu các
vitamin đặc hiệu đều là những đặc tính có giá trị. Định danh xác định của hầu hết
nấm sợi dựa vào hình thái học vi thể. Bệnh phẩm soi kính hiển vi phải được chuẩn
bị bằng phương pháp hạn chế tối đa mọi sự đứt gãy liên kết của bào tử với các cấu
trúc sinh sản tương ứng, tốt nhất là nuôi cấy lam kính. Sắc tố đen vách tế bào và
tính lưỡng hình khi thay đổi nhiệt độ cũng là những đặc điểm quan trọng.


13

-

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh
Mặc dù còn những băn khoăn về sự đào thải nhanh chóng khỏi máu của các

kháng nguyên nấm và độ tin cậy của các xét nghiệm kháng thể trên bệnh nhân suy
giảm miễn dịch, các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên nấm đặc hiệu, kháng thể
vẫn được đặt ra để rút ngắn thời gian chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập.
β-D-glucan là thành phần cấu tạo vách tế bào các loài Candida, Aspergillus
và nhiều loài nấm khác. Kết quả dương tính thật với β-D-glucan gợi ý khả năng
nhiễm nấm xâm nhập. Vấn đề chính của xét nghiệm này là độ đặc hiệu thấp và
dương tính giả cao, đặc biệt trên các nhóm bệnh nhân Hồi sức tích cực do ở các
bệnh nhân này thường gặp các yếu tố gây dương tính giả như: nhiễm trùng hệ thống
(nhiễm khuẩn huyết do các vi khuẩn Gram âm và Gram dương), một số kháng sinh
(amoxicillin – clavulanate dùng đường tĩnh mạch), lọc máu, nấm cư trú, truyền
albumin hoặc immunoglobulin. Do đó xét nghiệm này chỉ có ý nghĩa khi dương tính
nhiều lần liên tiếp hoặc trên những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặc yếu tố
nguy cơ đặc trưng gợi ý nhiễm nấm xâm nhập. Ngoài ra, thử nghiệm β-D-glucan
chưa được nghiên cứu đầy đủ trên trẻ em nên không được khuyến cáo sử dụng trong

phương pháp đa trung tâm.
.1.2.4.

Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm nấm xâm nhập

Nhiễm nấm xâm nhập gồm ba mức độ [24]:
-

Nhiễm nấm xâm nhập xác định: Có bằng chứng xét nghiệm vi sinh hoặc giải
phẫu bệnh trên bệnh phẩm vô trùng dương tính với nấm (Bảng 1.2.).

-

Nguy cơ cao nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàng
và 1 tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)

-

Có thể nhiễm nấm xâm nhập: Có yếu tố vật chủ, 1 tiêu chuẩn lâm sàng
nhưng không có tiêu chuẩn cận lâm sàng nấm học (Bảng 1.3.)


15

2.

Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định nhiễm nấm xâm nhập trừ các

bệnh nấm tại chỗ [24]
Kỹ thuật

thường vô khuẩn và có bất (dưới 24 giờ)) từ mội vị trí thường vô
thường về lâm sàng hoặc X- khuẩn có bất thường về lâm sàng
quang phù hợp với bệnh lý hoặc X-quang phù hợp với bệnh cảnh
nhiễm trùng, bao gồm dịch rửa nhiễm trùng.
phế quản phế nang, bệnh phẩm
xoang sọ và nước tiểu.
Cấy máu ra nấm sợid (như Cấy máu ra nấm men (như các loài

Máu

Fusarium sp.) trong bệnh cảnh Cryptococcus hoặc Candida) hoặc

Huyết

nhiễm trùng phù hợp.

nấm dạng nấm men (như các loài

Không ứng dụng được.

Trichosporon).
Kháng nguyên Cryptococcus trong

thanh

dịch não tủy cho thấy nhiễm

học : dịch

Cryptococcus lan tỏa.


nấm tại chỗ [24]
-

Yếu tố vật chủ:
o Tiền sử giảm bạch cầu gần đây (< 0,5 G/l trên 10 ngày) liên quan đến
thời điểm khởi phát bệnh nấm;
o Bệnh nhân ghép tế bào gốc đồng loài;
o Sử dụng corticoid kéo dài (ngoại trừ các bệnh nhân nhiễm Aspergillus
phế quản phổi dị ứng) với liều trung bình tối thiểu 0,3 mg/kg/ngày
đương lượng prednisone trên 3 tuần;
o

Điều trị bằng các chất ức chễ miễn dịch tế bào T đã biết khác,
như cyclosporine, thuốc chẹn TNF-α, kháng thể đơn dòng đặc
hiệu (như alemtuzumab), hoặc các chất tương tự nucleoside
trong 90 ngày gần đây;

o Thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh nặng (như bệnh u hạt mạn tính hoặc
-

thiếu hụt miễn dịch kết hợp nặng).
Tiêu chuẩn lâm sàng:
o Bệnh nấm đường hô hấp dướic : Có 1 trong 3 biểu hiện trên CT :
 Tổn thương đặc, viền rõ, có/ không có dấu hiệu quầng sáng;
 Dấu hiệu hình liềm hơi;
 Hang.
o Viêm khí phế quản:
 Có loét khí phế quản, cục nhỏ, giả mạc, mảng bám hoặc vảy



-

Nhiễm nấm xâm nhập trừ bệnh do Cryptococcus và các nấm lớp
Zygomycetes : Phát hiện β-D-glucan trong huyết thanh.