www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC
------------

LÊ THỊ HỒNG NHUNG

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ
NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L. MERR.).

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

1


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình
nghiên cứu trước đây.

Tác giả luận án

nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà nội, ngày……. tháng…… năm 2014
Tác giả luận án

3


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ………….……………………………….………... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………….……..........vi
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………..…... iix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………ix
MỞ ĐẦU………….……………………………….………………..…...……… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu.............................................................. 3
1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) .............................................. 3
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt ................................................. 3
1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu loài Thông lá dẹt ............................................ 4
1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus ... 5
1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) ....................... 8
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương ......................................... 8
1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương ............... 9
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu của loài Ngũ gia bì hương .............................. 9
1.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 14
1.2.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 14
1.2.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 16
1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane ................................................... 19

2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương ............. 34
2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc................................................................ 34
2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ................................................ 35
2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ........................................ 35
2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ................................................................ 35
2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................. 37
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 39
3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ........................................... 38
3.1.1. Cặn chiết n-hexane .................................................................................. 40
3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) .............................................................. 40
3.1.2.1. Phân lập chất.................................................................................. 40
3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 42
3.1.3. Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) .............................................................. 43
3.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) ................ 45
3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương ..................................... 45

5


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

3.2.1.1. Quá trình phân lập.......................................................................... 45
3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 48
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 ....................................... 48
3.2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 ............................................. 48
3.2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 ............................................. 57
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 64
4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte).......................... 64
4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane ................................................... 64
4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc .................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 133
PHỤ LỤC

7


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1

Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3β-OH tạo các hợp chất

22

56.1–56.8
Sơ đồ 1.2

Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3β-OH tạo hợp chất 57

23

Sơ đồ 1.3

Chuyển hóa nhóm 3β-OH, 28-OH của betulin

23

Sơ đồ 1.4

Sơ đồ 1.9

Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid

27

Sơ đồ 1.10

Oxi hóa nối đôi ∆ 20(29) của betulinic acid

28

Sơ đồ 1.11

Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87

29

Sơ đồ 1.12

Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid

30

Sơ đồ 1.13

Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid

31


Ngũ gia bì hương
Sơ đồ 4.1

Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1

106

Sơ đồ 4.2

Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2

112

8


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1

Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt

4

Hình 1.2

Hình ảnh về loài Ngũ gia bì hương


70

Hình 4.5

Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD3OD)

70

Hình 4.6

Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD3OD)

71

Hình 4.7

Phổ khối FT-IR của chất PK3

73

Hình 4.8

Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3

73

Hình 4.9

Phổ 1H-NMR của chất PK3 (500 MHz, CD3OD)


Phổ 13C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD3OD)

78

Hình 4.15

Phổ FT-IR của chất PK5

80

Hình 4.16

Phổ 1H-NMR của chất PK5 (500 MHz, CD3OD)

81

Hình 4.17

Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK5 (500 MHz, CD3OD)

81

Hình 4.18

Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD3OD)

82

Hình 4.19


Chất burselignan (PK7a)

87

9


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Hình 4.25

Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7

88

Hình 4.26

Phổ 1H NMR của chất PK7 (500 MHz, CD3OD)

89

Hình 4.27

Phổ 13C và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD)

89

Hình 4.28

Phổ HSQC của chất PK7


95

Hình 4.34

Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2

97

1

Hình 4.35

Phổ H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl3)

97

Hình 4.36

Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl3)

98

Hình 4.37

Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3

100

Hình 4.38


Hình 4.43

Phổ HSQC của chất AT3

103

Hình 4.44

Phổ HMBC của chất AT3

104

Hình 4.45

Phổ COSY của chất AT3

104

10


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi


Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT15 – AT17

55

Bảng 3.4

Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT20 – AT23

58

Bảng 4.1

Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n-

64

hexane bằng phương pháp GC-MS
Bảng 4.2

Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK1 và tectochrysin
1

13

66

Bảng 4.3

Số liệu phổ H, C-NMR của PK2 và pinostrobin


C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và

87

C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy-

93

13

Burselignan
Bảng 4.9

Số liệu phổ 1H-,

13

3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid
Bảng 4.10

Số liệu phổ

1

H-,

13

C-NMR của AT1 và 24-nor-3α,11α


120

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1

H-NMR

Proton Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Resonance Spectroscopy
13

C-

Carbon -13 Nuclear Magnetic

NMR

Resonance Spectroscopy

DEPT

Distortionless Enhancement by

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Phổ DEPT


1

H-1H

COSY
ESI-MS

Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử

Electron Spray Ionization-Mass
Spectroscopy

HR-ESI-

High Resolution Electron Spray

Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng

MS

Ionization Mass Spectroscopy

phun mù điện tử

FT-IR

Infrared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại


multiplet

J (Hz)

Hằng số tương tác (Hz)

12


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

δ (ppm)

Độ dịch chuyển hóa học tính

(ppm = part per million)

bằng ppm (phần triệu)
CC

Column Chromatography

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

KB


12-O-Tetradecanoylphorbol-13acetate

IC50

Inhibitory concentration 50%

Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm

EC50

Effective concentration 50%

Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử
nghiệm

MIC

Minimum inhibitory concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

Ac

CH3CO-

Acetyl

Me

-CH3


TEA

Triethylamine

AZT

Azidothymidine

TBDPSCl

Tert-Butyldiphenylchlorosilane

DIBALH

Diisobutylaluminium hydride

EDCI

1-Ethyl-3-(3-

13


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

dimethylaminopropyl)carbodiimide
PL
rt



www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

15


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

MỞ ĐẦU

Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y
dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học
kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to
lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất
lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng
làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua
L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus
Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngoài ra, người ta còn có thể
sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa
bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều
trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở
nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua,
Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả
năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên
cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và
thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn
tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá.
Ngoài việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học còn
tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các
hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn. Đây cũng là một

3. Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được
4. Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis, khả
năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa của các dịch
chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu
ứng dụng các hợp chất này trong công nghệ hóa dược.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

17


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

1.1.

Tổng quan về hai loài nghiên cứu

1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
1.1.1.1.

Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt

Thông lá dẹt hay còn được gọi là Thông hai lá dẹt hay Thông lá dẹp, Thông
Sré (Pinus krempfii, tên đồng nghĩa là Ducampopinus krempfii (Lecomte) A. Chev),
thuộc chi Pinus, họ Thông Pinaceae. Loài này được ví như “sứ giả thời tiền sử” sinh cùng thời với khủng long, là một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót
lại cho đến ngày nay. Hiện tại, Thông hai lá dẹt được xếp ở loài hiếm, mức độ đe
dọa có thể bị tuyệt chủng (bậc R) do nạn săn lùng của sơn tràng và do môi trường
sống của chúng (rừng) bị thu hẹp đáng kể. Loài thông cổ với đặc trưng là có hai lá
dẹt hình lưỡi kiếm, là loài đặc hữu của Việt Nam, nó phân bố hẹp ở tỉnh Lâm Đồng
và đây là loài thông được nhiều nhà thực vật học trên thế giới hết sức quan tâm [1],


loài Thông lá dẹt
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một công trình
nghiên cứu về thành phần hóa học loài này của Holger Erdtman, Thụy Sĩ được công
bố vào năm 1966. Từ thân gỗ Thông lá dẹt thu tại Nha Trang, Việt Nam, 10 chất là
chrysin

(5,7-dihydroxyflavone)

(1),

strobopinin

(2),

cryptostrobin

(3),

demethoxymatteucinol (6,8-dimethylpinocembrin) (4), pinosylvin (5), pinosylvin
monomethylether (6), tectochrysin (7), pinobanksin (8), pinocembrin (9),
pinostrobin (10) đã được nhóm nghiên cứu này phân lập và nhận dạng [4]. Điều thú

19


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

vị là tất cả các hợp chất này đều thuộc nhóm flavanoid. Trong đó, các hợp chất Cmethyl flavanoid như 2, 3, 4, 8, 9 là các hợp chất có cấu trúc thú vị [4],[5]:
HO

HO

O
H

H3C

H
OH

O

4

RO
O

O

HO
OH

5: R = H
6: R = Me

HO

O

O

của chi Pinus
Trong khi loài Thông lá dẹt mới chỉ được nghiên cứu rất ít thì có nhiều loài
thuộc chi Pinus lại có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh
học đã được công bố và cho thấy có nhiều điều thú vị ở chi này. Theo thống kê trên
thế giới đến năm 2012 có trên 450 hợp chất được phân lập từ hơn 80 loài thuộc chi
20


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpene (diterpene
khung abietane, cembrane; lignan; steroid….), phenol, flavonoid và flavonoid
glycoside [5], [6].
Hầu hết các loài thông đều có chứa tinh dầu và nhựa. Thành phần chính là
các acid thuộc khung abietane, pimarane và monoterpenoid đặc trưng như α,βpinene, có thể còn có β- phellandrene (P. contorta, P. banksiuna). Tuy nhiên, ở một
số loài P. sylvestris, P. albicaulis lại thấy có sự xuất hiện của sesqui- và diterpene
như (+)-δ-cadinene, (-)-torreyol. Đặc biệt, loài P. jefieyi có thể sản sinh ra loại nhựa
mà thành phần chính của nó là n-heptane, một hợp chất không có sự liên quan nào
đến các hợp chất terpene.

H

OH

H

H

torreynol



www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra
Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [11].
Ngoài ra, tinh dầu của một số loài khác như P. halepensis Mill., P.
densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt
[12], [13].
1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)
1.1.2.1.

Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương

Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,
thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m,
có phân cành,vỏ lúc non màu xanh, khi già
màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc; cuống dài
2,5-3,5 cm, có gai; 3-5 lá chét, từ hình trứng
thuôn có mép khía răng khô đến hình thuôn dài
ở mép có gai nhọn (var. setosus Li), lá chét
giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích
thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm. Cụm hoa
dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng
ngà hay trắng ngà, có cuống mảnh, dài 0,7-1
cm. Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn
đầu. Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa. Bầu 2 ô,
đầu nhụy chẻ đôi. Quả hình cầu, hơi dẹt, khi
chín màu tím đen. 1-2 hạt nhỏ. Vỏ thân, vỏ rễ
và lá vò nát có mùi thơm đặc biệt [14], [15],


Rễ và cành lá dùng chữa: 1. Cảm mạo sốt cao, ho, đau ngực; 2. Đau lưng,
phong thấp đau nhức khớp; 3. Đau dạ dày, viêm ruột, đau bụng tiêu chảy; 4. Vàng
da, viêm túi mật; 5. Sỏi niệu đạo, bạch đới; 6. Gãy xương, viêm tuyến vú. Dùng 30 60g, sắc uống; 7. Dùng ngoài chữa đòn ngã, eczema, mụn nhọt và viêm mủ da. Rễ
tươi và lá được giã đắp ngoài hoặc nấu nước rửa, tắm.
Cành nhỏ nấu lên rửa, tắm chữa ngứa, ghẻ. Rễ và lá của nó cùng với hoa cúc
trắng giã nhỏ đắp mụn nhọt và nứt kẽ chân cũng có công hiệu [14], [15], [16].
1.1.2.3.

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của loài Ngũ gia bì hương
Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
loài cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) đã được các nhà
khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố.
a. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm chất triterpene
đã được tìm thấy từ loài cây này.

24


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Năm 1971, các nhà khoa học của Đại học Quốc gia Đài Loan đã nghiên cứu
về thành phần của loài này thu hái ở Taipei - Đài Loan. Từ dịch chiết MeOH, các
hợp chất (1,2,3,4,5,6)-cyclohexanehexol (scyllitol, 11) và myo-inositol (12) đã được
phân lập. Cũng chính từ cặn chiết này khi hòa tan trong nước và chiết phân lớp với
benzene nhóm tác giả đã phân lập được taraxerol (13), β-sitosterol (14), các ankan
C29 – C33, hai rượu béo triacontanol (15) và dotriacontanol (16) [17].