VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------------------

VŨ DUY THANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH
GIÁ SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN
HIẾU KHÍ TRONG KHÔNG KHÍ MÔI TRƯỜNG
LAO ĐỘNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội - 2014


MỞ ĐẦU
Trong không khí, ngoài bụi là thành phần chính còn có các vi sinh vật như vi
khuẩn, nấm mốc, các thành phần này có liên quan mật thiết với nhau như nồng độ
bụi, bụi hữu cơ càng nhiều thì số lượng vi sinh vật càng nhiều, vi sinh vật trong
không khí gồm rất nhiều loại khác nhau như cầu khuẩn gây bệnh, trực khuẩn lao,
trực khuẩn bạch hầu và các tạp khuẩn khác, quan trắc vi sinh vật trong không khí là
một cách để dự phòng và định hướng những nguy cơ tiểm ẩn gây ra bởi ô nhiễm
sinh học trong không khí. Điều kiện ngoại cảnh và điều kiện thời tiết có ảnh hưởng
rất nhiều tới tình trạng và số lượng vi sinh vật trong không khí, khí hậu Việt Nam
thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm và ẩm, trong cả nước Việt Nam có những vùng
khác nhau về khí hậu như ở miền Bắc thì thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm ẩm, vùng
khí hậu khu vực miền Trung thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, vùng khí hậu vùng phía
nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới Xavan (có hai mùa rõ rệt là mùa khô và mùa
mưa), chính vì sự đa dạng này mà trong các vùng của Việt Nam có sự phân bố số

tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của
nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động”, với các mục
tiêu và nội dung chính sau đây:
Mục tiêu cơ bản của đề tài luận văn:
- Đánh giá được tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong môi trường không khí lao
động.
- Có quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong không khí môi
trường lao động.
Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát chọn lựa môi trường nghiên cứu cũng như khảo sát lấy mẫu không
khí.

- Quan trắc môi trường không khí lao động.

- Đánh giá ô nhiễm chất lượng môi trường không khí tại cơ sở sản xuất thực
phẩm.
- Xây dựng quy trình phân tích nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi
trường lao động
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Đề tài góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong việc nghiên cứu sự có mặt của nấm và
vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động.
- Đưa ra một quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong không
khí môi trường lao động.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ TRÊN
THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.1.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật trong không khí trên thế giới
Thế giới đã quan tâm nhiều đến sự tồn tại và phát tán của các vi sinh vật

phương pháp đặt đĩa thạch [6]. Năm 2011 có nhiều nghiên cứu khảo sát mức độ
nhiễm nấm môi trường không khí phòng không máy lạnh, các dược liệu đang bán
tại thành phố Hồ Chí Minh, mức ô nhiễm đều vượt qua mức giới hạn cho phép tiêu
chuẩn WHO [36].
1.2. SỰ TỒN TẠI CỦA VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ
Môi trường không khí không phải làm môi trường có thành phần dinh
dưỡng, vi sinh vật không sinh trưởng trong không khí, vi sinh vật chúng bám vào
các hạt bụi lơ lửng bay trong không khí, đã tìm thấy rất nhiều những loại vi sinh vật
khác nhau tồn tại trong không khí. Qua đó nhiều người đã có những quy định chung
về tên gọi là Bioaerosol. Bioaerosol được hiểu là bao gồm các hạt bụi sinh học lơ
lửng trong không khí trong đó có cả vi khuẩn và nấm, các hạt phấn hay bào tử khác.
1.2.1. Vi khuẩn trong không khí
Vi khuẩn không tồn tại độc lập trong môi trường không khí vì vi khuẩn là
sinh vật rất nhỏ nó không thể tự phát tán và di chuyển trong không khí được và nó
thường bám vào các hạt bụi lơ lửng trong không khí hay các dạng hạt khác có thể di
chuyển lơ lửng trong không khí, sự phát tán của vi khuẩn trong không khí là gián
tiếp nhờ các vật chủ khác có thể bay lơ lửng trong không khí, di chuyển từ nơi này
đến nơi khác nhờ sự tác động của gió, bão, sự chuyển động trong không khí đưa đẩy
các hạt bụi trong không khí.
Vi khuẩn không sinh trưởng được trong không khí nhưng hiện nay các nhà
khoa học đã tìm thấy những nguy cơ tiềm ẩn các rủi do có nguồn gốc từ không khí.
Nhưng một số loài vi khuẩn vẫn có thể tồn tại vài giờ đến vài tháng trong môi
trường không khí được, như vi khuẩn lao chẳng hạn nó có thể tồn tại trong môi


trường tự nhiên khoảng 3 ÷ 4 tháng, vì chúng có thể bám vào các hạt bụi lơ lửng
trong không khí.
1.2.1.1. Bacillus trong không khí
Vi khuẩn Bacillus bao gồm những loại vi khuẩn hình que, Gram (+), hiếu khí
thuộc họ Bacillaceae, chúng có mặt ở khắp nơi, cả nhưng nơi có điều kiện khắc

màu trắng ngà được gọi là tụ cầu trắng. Chúng là tác nhân gây nhiều loại bệnh khi
chúng bám và cư trú các bộ phân của cơ thể như trên da, khoang miệng, gây viêm
phổi cấp tính nếu như bị hít phải. Trong thực phẩm vi khuẩn chỉ cần 1,0 x
102CFU/g thức ăn đủ để bị ngộ độc, vi khuẩn này rất nguy hiểm nếu như chúng xuất
hiện trong môi trường không khí. Khi bị nhiễm trùng da, mô tế bào, áp xe do vi
khuẩn S. aureus khi mổ ra chúng tạo thành mủ có màu vàng, đặc, không hôi. Chúng
còn gây ra nhiều loại viêm nhiễm khác trong các bộ phận trong cơ thể khi chúng
theo các tuyến dịch hay vết thương hở[10]; [36].
1.2.2. Nấm và nấm mốc trong không khí
Giới nấm (Fungi) là nhóm sinh vật đơn ngành thuộc dạng tế bào nhân thực,
Cơ thể là đơn bào hoặc đa bào dạng sợi, có thành kitin (trừ một số ít có thành
xenluloza), không có lục lạp, Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh và cộng sinh, sinh
sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử thường không có lông và có thể có roi. Nấm phát
triển trong điều kiện có sẵn chất hữu cơ và ở nhiệt độ từ 25 ÷ 30 oC, Ở 0oC thì nấm
không phát triển được, ở nhiệt độ 100 oC giết chết nhiều loại nấm, trong hệ thống
phân loại 5 giới của RH, (Whittaker the five kingdom system) nấm thuộc giới riêng
rẽ được gọi là giới nấm, Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100
giống và hơn 50.000 loài đã được mô tả, nhưng ước tính có đến trên 250.000 loài
nấm có mặt trên trái đất này.
Nấm có nhiều loài như vậy có cả những loài có lợi và có cả những loài có
hại, còn tùy vào sự hiện diện của nó ở đâu, trong điều kiện nào và trên cơ chất gì.
Chúng sẽ tạo ra các chất ngoại độc tố và nội độc tố gây hại cho môi trường xung


quanh nó. Nấm có các dạng điển hình gồm nấm men và nấm sợi, chúng khác nhau
về nhiều đặc điểm sinh học.
Nấm men (Yeast) là sinh vật đơn bào, sinh sản bằng nảy mầm chồi hoặc phân
cắt. Hình dạng và cấu trúc của nấm ở thể đơn bào có hình trứng (thường là nấm
men), đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn
bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy

1.2.2.3. Một số loài nấm khác trong không khí
Một số loài nấm khác thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên
người, Microsporum gây bệnh trên chó, A. fumigatus gây bệnh trên chim;
Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên
cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora[18].
1.3. ẢNH HƢỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ TỚI SỨC KHỎE
CỘNG ĐỒNG
1.3.1. Ảnh hƣởng của vi khuẩn đến môi trƣờng và sức khỏe cộng đồng
Vi khuẩn hiếu khí là vi khuẩn có thể mọc và sống được khi có sự xuất hiện
của oxy. Vi khuẩn hiếu khí bao gồm rất nhiều loài, có những loại gây dị ứng, gây
bệnh truyền nhiễm, gây độc, nhóm vi sinh vật tồn tại một số lượng lớn trong môi
trường là một hiểm họa tiềm ẩn có thể bùng phát dịch bệnh bất cứ lúc nào, nếu như
khi gặp điều kiện môi trường sống thuận lợi những vi sinh vật gây bệnh này bùng
phát thành ổ dịch và nếu không kiểm soát kịp thời có thể trở thành đại dịch, những
bệnh có thể gặp phổ biến như viêm phổi cấp, lao, tả lỵ, thương hàn đó là những
bệnh thường gặp nhất, ngoài ra còn rất nhiều những bệnh khác có thể gặp đối với
những người mẫn cảm, hay cơ địa của người đó phù hợp với điều kiện sinh trưởng
và phát triển của loại vi sinh vật gây bệnh này, sự lây truyền bệnh truyền nhiễm gây
ra bởi vi sinh vật thông qua con đường không khí là rất khó kiểm soát, nó có thể
phát tán trong một không gian rộng lớn.
Trong không khí có rất nhiều loại vi khuẩn có cả những loài có lợi, nhưng
có không ít những loài gây hại cho sức khỏe của sinh vật, động vật và con người. Vi


khuẩn chủ yếu gây ra những bệnh như nhiễm trùng khác nhau và tốc độ gây bệnh
rất nhanh có thể gây tử vong nếu không kịp thời điều trị như hô hấp cấp tính ( S.
aureus, và S. epidermidis) hay C. trachomatis gây ra bệnh mắt hột, Mycoplasma
pneumoniae gây ra bệnh viêm phổi. Những loài gây ra dịch tả như

(Vibrio

Heo là loài gia súc nhạy cảm với độc tố tricothecenes.
F2-Toxin(zearlenon): do F. roseum sinh ra, theo quan sát thấy nhiều trên bắp,
lúa mạch, lúa mì. Heo là loài động vật rất dễ quan sát, khi bị nhiễm độc thì âm hộ bị
sưng đỏ, đôi khi núm vú cũng sưng đỏ, có thể dẫn tới sa trực tràng và âm đạo, tử
cung nở rộng và có hiện tượng thoái hóa buồng trứng. Zearalenon gây
,

. Zearalenone có tác dụng trực tiếp lên cơ quan sinh dục
cái gây sẩy thai, nhưng nó không có tác dụng làm giảm lượng thức ăn ăn vào như
tricothecenes [17]; [32].
Trong số các độc chất ở trên thì độc tố aflatoxin có mức nguy hiểm lớn nhất.
Aflatoxin bao gồm 6 loại khác nhau (B1, B2, G1, G2, M1 và M3), trong đó độc tính
cao nhất là aflatoxin B1. Sự nguy hiểm ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liều
lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 mg cũng đã đủ làm hỏng gan. Độc chất
này lại bền vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100 oC ở nồi bình thường hoặc nhiệt độ
cao hơn ở nồi áp suất, hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc thì aflatoxin
vẫn không bị phân hủy.Ngoài khả năng tạo ra một số loại độc chất thì có một số
bệnh nguy hiểm đã được tìm thấy nguyên nhân là do các loại nấm gây ra.
Bệnh lý về bệnh nấm phổi được phát hiện từ cuối thế kỷ 19 và là bệnh có
nguy cơ tử vong rất cao. Bệnh Aspergillomas phần lớn gây nhiễm trùng ở phổi và
rất hiếm khí gặp tuy nhiên các nhà khoa học đã phát hiện ra một bệnh nhân tại Ý đã
bị mắc chứng bệnh này, khối nấm trong người bệnh nhân này quá lớn với chiều
rộng hơn 7 cm, và bênh nhân này được điều trị tại Bệnh viện Catania ở Ý. Nguyên
nhân gây ra chứng bệnh này là do bào tử vi nấm Aspergillus xâm nhập vào phổi qua


đường khí quản và tạo ra một lỗ hổng trong lá phổi, bào tử này cư ngụ ở đây và nẩy
mầm dẫn đến sưng phổi và bị ho lao nếu như không được phát hiện và điều trị kịp
thời. Trước đây cho rằng chỉ có tác nhân hóa học mới gây ra ngộ độc cấp tính cho
con người, còn các cá nhân sinh học chỉ có thể gián tiếp gây ra các bệnh tật cho con

Các thiết bị ra đời sau này đã được cải tiến rất nhiều và đã được sử dụng trong nhiều
nghiên cứu lấy mẫu vi sinh gây bệnh trong không khí đó chính là thiết bị Anderson.
Thiết bị này được phân tầng theo kích thước của hạt sinh học lơ lửng, mỗi tầng
được đặt vật liệu giữ lại các hạt sinh học lơ lửng, ở các tầng, đưa các vật liệu này
nuôi ủ phòng thí nghiệm và phân loại vi sinh vật khác nhau. Thiết bị Anderson được
phân thành 6 tầng mỗi tầng có khoảng kích thước khác nhau, tùy mục đích nghiên
cứu và sử dụng có thể dùng một tầng trong đó để có kích thước lỗ phù hợp, ngoài ra
còn có các loại thiết bị lấy mẫu của các hãng khác thiết kế và sản xuất như thiết bị
SAS[19]; [28]. Thiết bị này có nguyên lý giống với thiết bị lấy mẫu Anderson đó
vẫn là lấy mẫu bằng phương thức hút trực tiếp. Thiết bị lấy mẫu Spin Air sử dụng
nguyên lý này để lấy mẫu vi sinh không khí với kích thước lỗ 0,4 mm và có 400 lỗ
trên bề mặt, bốn chế độ quay đĩa, tốc độ là 100 lít/phút, sử dụng đĩa thạch 90 mm.
1.4.1.1. Nguyên lý phương pháp hút trực tiếp
Nguyên lý của phương pháplà dùng lực hút chân không để hút không khí đi
vào thiết bị và được lưu giữ các hạt bụi trong đĩa thạch. Tùy từng loại thiết bị sử
dụng loại vật liệu lọc khác nhau mà không khí được lọc qua lỗ lọc cho không khí đi
qua và giữ lại vi sinh vật trên vật liệu đó. Thiết bị lấy mẫu được nhiều tác giả sử
dụng nhiều nhất hiện nay là dạng thiết bị Anderson, method 0800 của NIOSH cũng
sử dụng thiết bị lấy mẫu Anderson 2 tầng để lấy mẫu. Phương pháp lấy mẫu
Anderson thì thiết bị lấy mẫu được hút bằng một bơm hút qua các tầng đặt môi
trường thạch với những kích thước lỗ khác nhau, thường thời gian lấy mẫu khoảng
5 ÷ 15 phút, đĩa thạch được lấy ra và đưa vào tủ ấm giữ ở nhiệt độ 37 ± 0,5 oC trong
thời gian 1 ngày (đối với vi khuẩn) còn 3 ÷ 5 ngày đối với nấm mốc. Ưu điểm của
phương pháp này là có thể lấy mẫu ở kích thước nhỏ có thể đi trực tiếp vào phổi (2


÷ 4 µm) và với phương pháp lấy mẫu này cũng có thể lấy được cả những vi khuẩn
hiếu khí[6]; [28]; [36]. Nhiều thiết bị lấy mẫu có tốc độ rất lớn có thể đạt tới 180
lít/phút và có loại kép hai đầu lấy mẫu vẫn đạt tới 180 lít/phút cho mỗi bên, các thiết
bị này rất phù hợp để lấy mẫu trong khu vực có tốc độ lưu thông không khí lớn, vận

dưỡng lỏng, hay gọi là dung dịch đệm, dụng cụ sử dụng là ống impingers để thực
hiện lấy mẫu, nguyên tắc lấy mẫu theo dạng hấp phụ. Hiện nay thiết bị chuyên dụng
cho việc lấy mẫu sinh học bằng dung dịch được hãng thiết bị thí nghiệm SKC sản
xuất với các loại khác nhau và thiết bị có tốc độ lớn nhất với vận tốc hút mẫu 12 lít
trên phút, lấy mẫu trong một thời gian dài. Ưu điểm lấy mẫu theo phương pháp này
là có thể lấy trong thời gian dài có tùy theo mục đích của các nghiên cứu, số lượng
dung dịch sử dụng khoảng 15 ÷ 20 ml cho mỗi một lần lấy mẫu. Đối với phương
pháp này cũng rất thuận tiện cho việc lấy các mẫu sinh học khác như vi khuẩn, vi
nấm, nấm men, virus, hay các hạt sinh học như hạt phấn, hạt bào tử… các sản phẩm
tạo ra các loại nội độc tố và độc tố của nấm mốc. Mẫu lấy từ phương pháp này có
thể sử dụng cho các phương pháp hiện đại hiện nay như PCR, phương pháp Elisa,
ADN… xác định trực tiếp ra loại gì có nguy cơ gây bệnh như thế nào. Tuy nhiên
hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều ứng dụng để thực hiện theo phương pháp này
trong quan trắc môi trường, cũng như những nghiên cứu khác liên quan đến vi sinh,
hay mẫu sinh học không khí.
Lấy mẫu bằng phương pháp này dung dịch đệm hay trực tiếp là các môi
trường lỏng, sau khi lấy mẫu xong được đưa vào ống nghiệm và có thể sử dụng cho
việc nuôi cấy, cũng như có thể sử dụng cho các phương pháp test nhanh bằng
những kỹ thuật hiện đại. Đây cũng là phương pháp rất hữu ích cho việc nghiên cứu
các mẫu sinh học trong không khí và sử dụng để quan trắc chỉ tiêu sinh học trong
không khí ở nhưng khu vực có có sự lưu thông không khí nhỏ và vừa phải sẽ rất
hiệu quả, đồng thời phù hợp với những nghiên cứu về xác định DNA các mẫu sinh
học tồn tại trong không khí, sử dụng trong nghiên cứu miễn dịch hay nghiên cứu về


các tác nhân gây dị ứng như bụi phấn hoa, hay ứng dụng trong các mẫu nghiên cứu
về sinh hóa[21].
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích tại phòng thí nghiệm
Tại Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu cắt ngang về lĩnh vực phân tích
vi sinh vật tuy nhiên nó vẫn chưa có quy định nào thống nhất sử dụng rộng rãi vẫn

nhanh chóng và có độ chính xác rất cao, với phương pháp giải trình tự gen tiên tiến
hiện có thể tìm ra được các gen gây bệnh của vi sinh và gen quy định độc tố của các
vi sinh. Qua đây cảnh báo chất lượng môi trường có nguy cơ tiềm ẩn sự nguy hiểm
khi có mặt của những loại vi sinh đó trong không khí.
1.4.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Hiện nay, bên cạnh những phương pháp định loại vi sinh vật truyền thống, các
nhà khoa học còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại dựa trên trình
tự gen. Trong lĩnh vực vi sinh vật và vi sinh phân tử việc giải trình tự gen là hết sức
quan trọng, cho phép định danh, phân loại vi sinh vật tới cấp độ phân tử. Sử dụng
phương pháp sinh học phân tử để khẳng định chủng vi khuẩn tìm thấy trong không
khí có độ chính xác rất cao, khẳng định được chính xác vi khuẩn có nguy cơ gây
bệnh và nấm mốc có nguy cơ tạo ra chất độc ảnh hưởng tới thực phẩm, các chủng
gây bệnh cho người. Đối với vi khuẩn và xạ khuẩn xác định trình tự gen 16S rARN
là phương pháp đang được dùng phổ biến. Gen này có mặt trong tất cả các tế bào,
chứa vùng bảo thủ cao và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các loài khác nhau.
Với nấm mốc trình tự gen 28S rARN là nhiều người sử dụng hiện nay, giải trình tự
gen đối với nấm mốc. Giải trình tự gen cho thấy đọan gen hay bộ gen có độ tương
đồng là bao nhiêu so sánh gen chủng này trong ngân hàng gen sẽ xác định chính xác
chúng thuộc chủng vi sinh nào. Sử dụng phương pháp này để xác định vi sinh gây
bệnh và ngộ độc thực phẩm đang có mặt trong không khí môi trường lao động, cảnh
báo cho người lao động có biện pháp phòng tránh tiếp xúc với môi trường ô
nhiễm[30]; [31]; [34].


1.4.4. Phƣơng pháp vận chuyển và bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển mẫu lấy từ hiện trường di chuyển
về phòng thí nghiệm luôn đảm bảo không xảy ra sự ảnh hưởng đến mẫu thử trong
quá trình vận chuyển, sẽ làm sai khác kết quả quan trắc. Đảm bảo chất lượng kết
quả phân tích nấm mốc và TVKHK trong không khí, điều kiện bảo quản phải đảm
bảo thùng đựng vô khuẩn (thùng hút chân không là tốt nhất) và nhiệt độ 4 oC. Mẫu

giảm thiểu, giám sát tất cả những sai sót trong từng bước thực hiện đó, QA/QC
trong quá trình lấy mẫu cần ngay từ những việc nhỏ nhất đó là thiết lập cỡ mẫu, có
lấy mẫu trắng, mẫu đối chứng, lấy mẫu vị trí nào, chiều cao khi lấy mẫu, sau đó đến
dụng cụ lấy mẫu, vật liệu hấp phụ, môi trường lấy mẫu, dụng cụ bảo quản sau khi
lấy mẫu, sổ tay hướng dẫn cho nhân viên thực hiện lấy mẫu luôn bảo đảm theo tiêu
chuẩn đặt ra, sổ ghi lại nhật ký lấy mẫu, ký hiệu mẫu để mã hóa và nhận dạng sau
khi đưa về phòng thí nghiệm, thiết bị lấy mẫu tại hiện trường đã đảm bảo về độ vô
trùng, bảo dưỡng và hiệu chuẩn trước khi đưa đi lấy mẫu chưa, như vậy tất cả các
bước này luôn luôn phải tuân thủ theo tiêu chuẩn hiện hành yêu cầu, QA/QC áp
dụng quá trình lấy mẫu cần phải thiết kế được mẫu trắng cho dụng cụ chứa mẫu,
mẫu trắng dụng cụ lấy mẫu, mẫu trắng vận chuyển.
Áp dụng QA/QC trong phòng thí nghiệm để phép thử đảm bảo độ chính xác
cao, ngoài việc lấy mẫu tại hiện trường đảm bảo chất lượng thì tại phòng thí nghiệm
cũng phải đảm bảo chất lượng tương tự như vậy thì mới có được kết quả có độ
chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm phải đảm bảo các thiết bị trong phòng thí
nghiệm đảm bảo là đã thực hiện hiệu chuẩn đầy đủ và tuân thủ quy trình thời gian
bảo dưỡng và hiệu chỉnh khi cần thiết. Đối với những phép thử vi sinh cần có phân
biệt rõ ràng khu vực chuẩn bị môi trường nuôi cấy, khu vực cấy mẫu đảm bảo độ vô
trùng, khu vực bảo quản môi trường luôn đảm bảo tuân thủ yêu cầu điều kiện môi
trường đảm bảo chất lượng hóa chất. Khu xử lý mẫu vi sinh sau khi thử nghiệm,
chất thải hóa học và môi trưởng nuôi cấy bị hỏng… tất cả nhưng điều kiện như vậy


đã được quy định rõ trong QA/QC. Tuân thủ chương trình này để đảm bảo chất
lượng cho phép thử.
1.6. SỰ CẦN THIẾT TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH KHÔNG KHÍ
Hiện nay mức độ ô nhiễm môi trường không chỉ ngày một tăng, ô nhiễm
nước, ô nhiễm đất, khói bụi rất lớn, bụi vô cơ, bụi lơ lửng, gây ô nhiễm không khí
nghiêm trọng và mức độ ô nhiễm các hạt bụi sinh học trong không khí cũng là rất
lớn và lại chưa được ai quan tâm nhiều. Mức độ ô nhiễm ngày càng lớn như bệnh


Tổng bioaerosols
(Vi khuẩn + Nấm)

1

Braxin

-

750

-

2

Canada

-

150

-

3

Trung Quốc

2.500 ÷ 7.000b


-

800

7

Bồ Đào Nha

8

Hà Lan

9

Nga

500
10.000

-

10.000

-

2.000 ÷
10.000c

-


giới (WHO)

13

Liên minh châu Âu
(EU)

10.000h
2.000i

10.000h
2.000i

-

14

Viện Quốc gia về
vệ sinh an toàn
thực phẩm Mỹ
(NIOSH)

-

-

1.000

15


tốc hút khí là 100 lít/phút và 60 lít/phút và có 4 chế độ quay vòng chậm trong quá
trình lấy mẫu, số lượng lỗ trên lắp lấy mẫu là 400 kích thước lỗ là 0,7 mm.
Thiết bị trong phòng thí nghiệm bao gồm: Tủ ấm, Đức.Máy khuấy từ IKA,
Ý. Kính hiển vi soi nổi Bel, Ý. Kính hiển vi sinh học Nikon E100, Nhật Bản.Tủ cấy
vi sinh, hệ thống phòng sạch và an toàn sinh học tại Viện Nghiên cứu KHKT Bảo
hộ lao động. Máy đếm khuẩn lạc SC 06 Bibby, Anh.
Dụng cụ thí nghiệm: đĩa Petri (90cm và 100 cm), ống đong, bình tam
giác,các dụng cụ để đi hiện trường: chân máy, các đĩa, dụng cụ bảo hộ lao động tiệt
trùng tại hiện trường.Thùng đựng môi trường đi hiện trường và thùng đựng mẫu đã
lấy ngoài hiện trường.Que cấy vi sinh, đèn cồn.Găng tay giầy ủng, khẩu trang y tế
dành cho cấn bộ thực hiện lấy mẫu và phân tích tại phòng thí nghiệm.
2.1.2.2. Hóa chất chính
+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

+ Cặp mồi cho phân loại nấm mốc:
NL1 (5 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ;
NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ')


2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm này sử dụng các loại môi trường rắn
(môi trường thạch): môi trường MacConkey, môi trường Sabouraud, môi trường
thạch máu, các thành phần môi trường được sử dụng hầu hết là của hãng Merck, có
đầy đủ chứng nhận chất lượng sản phẩm của hãng[1]; [2]; [3]; [6]; [20].
Môi trường MacConkey cơ bản (g/l): Pepton 20; lactoza 10; muối mật 1,5;
NaCl 5; thạch 20; nước cất 1.000 ml; pH 6,8 ÷7,0, khử trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường thạch máu (g/l): Thạch 15; pepton 5; meat extract 3; máu thỏ100
ml; nước cất 1.000 ml; điều chỉnh pH 7,4÷7,6, khử trùng121 oC,15 phút. Để nguội

mẫu trong thùng kín (thùng hút chân không là tốt nhất) Điều
kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Nuôi ủ tại phòng thí nghiệm, điều kiện nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm, tổng nấm 28 ± 0,5 oC, tổng vi khuẩn hiếu
khí 37 ± 0,5 oC

Đếm khuẩn lạc trên bề mặt đĩa thạch Petri
Tính kết quả bằng công thức 2.2 (mục 2.2.4.2.)

Phân loại vi sinh vật, chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang
môi trường chọn lọc để thuần và phân loại vi sinh vật

Hình 2.1.Sơ đồ phân tích tổng nấm và tổng vi khuẩn hiếu khí trong môi trường
không khí
Các bước xây dựng quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm cần phải xác
định được từng bước thực hiện như sau, nghiên cứu khảo sát môi trường chuẩn cho
nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí phù hợp nhất với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam.


Bước 1:Dùng các chủng vi khuẩn E. coli ATCC® 25922TM, E. aerogenes
ATCC® 13048TM cấy lên các môi trường MacConkey, TSA, NA, để xác định môi
trường này phù hợp với quy trình nghiên cứu. Còn với S. aureus
ATCC®25923TMsử dụng để cấy lên môi trường thạch máu, đây là loại vi sinh vật