WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT
SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC/MS-MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ

Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo dục,
người đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn
thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương – Giám Đốc
Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội người đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho
em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thành Đạt – Phó Giám Đốc
Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội đã hết lòng hướng dẫn em thực hiện khóa luận
này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Kiểm
Nghiệm Hà Nội, gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo
động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Hà nội, ngày 03 tháng 09 năm 2014
Học Viên
Nguyễn Văn Thuận

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI ................................15

1.4.

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI .........................................................17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........20
2.1.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ....................................20
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn .........................................................................20
2.1.2. Máy móc- thiết bị ................................................................................20
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................21

2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................21

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

2.2.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu ..................................................... 21
2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ................................................................ 21

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 54
4.1.

LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ...................................................... 54

4.2.

LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH.......................................................... 54

4.3.

Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................................................... 56
4.3.1. Tình hình kháng kháng sinh .................................................................. 56
4.3.2. Nghiên cứu dư lượng kháng sinh trong môi trường tại Việt Nam ...... 58

KẾT LUẬN .................................................................................................................. 60
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 61

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN


tR

Thời gian lưu

Spíc

Diện tích pic

SIS

Diện tích pic của chuẩn nội

TB

Trung bình

MeOH

Methanol

mg

Milligram

ml

Mililit

PA


WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

DANH MỤC CÁC BẢNG 
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin............................................................4
Bảng 1.2.Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu...............................5
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu cần có.......................................................................... 20
Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hóa ESI ...................................................................... 26
Bảng 3.2: Kết quả lựa chọn ion mẹ ............................................................................. 27
Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS ..................... 28
Bảng 3.4. Chương trình Gradient pha động ................................................................ 29
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát cột sắc ký ......................................................................... 31
Bảng 3.6. Khảo sát qui trình chiết pha rắn .................................................................. 37
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát qui trình chiết pha rắn ..................................................... 38
Bảng 3.8. Điều kiện LC và MS .................................................................................... 40
Bảng 3.9. Độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so
với chuẩn nội ................................................................................................................. 42
Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ của diện tích kháng sinh và chuẩn nội
theo nồng độ .................................................................................................................. 47
Bảng 3.11. Đánh giá độ chính xác và độ đúng của phương pháp ............................. 48
Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của phương pháp.................................................... 49
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ nhất ............................................... 51
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ hai ................................................. 52

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM


nhỏ kháng sinh thải ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi
khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc. Hướng nghiên
cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động
của chúng trong môi trường được bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế
kỷ 20 và rất được quan tâm tại các nước phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho
thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi
trường nước đã trở nên phổ biến [17], [36].
Song song với việc nâng cao chất lượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân
dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng. Hiện cả nước có khoảng
gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ
chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và
vitamin…Kháng sinh nhóm Cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng trên trực
khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta. Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản
xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên
nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh
nhóm Cephalosporin trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được
quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên

1

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



R1

NH

H

S

H

O

N
R3

O
HO

O

Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), mang cấu trúc

3

-cephem,

3

diện

Thế hệ Cephalexin

- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn

I

Cephalothin

Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu

Cephazolin

kháng methicillin).

…
Thế hệ Cefaclor

- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác

II

Cefuroxim

dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng

Cefotetan…

trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn.

các

Haemophilus,

vi

khuẩn

Pseudomonas,

Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu.
- Bền vững với β-lactamase.

1.1.2. Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin
nghiên cứu

4

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Bảng 1.2. Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu [3],[7],[14]
Tên chất


dung dịch kiềm loãng, thực tế
không tan trong ethanol 96%,
ether.

I

- Độ tan trong nước: 2,97.10-1 g/l
- pKa1= 3,45; pKa2 = 7,44
-Bột trắng hoặc gần như trắng. Ít
3.Cefixim

III

tan trong nước, aceton, glycerin,

C16H15N5O7S2

tan trong methanol, propylen
glycol, hơi tan trong ethanol, thực
tế không tan trong ether, ethyl
acetat và hexan, hầu như không
tan trong dung dịch sorbitol 70%
-Độ tan trong nước: 0,104 g/l.
-Hằng số pKa1 = 3,45; pKa2 = 2,92

5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

khăn kết nối với các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch
kết quả.
b. Chiết pha rắn
Chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE) là một phương pháp chiết dựa vào
sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được

6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

chiết từ pha lỏng vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào
các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ
được giữ lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung
môi khác phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so
với thể tích dịch ban đầu. Vì thế qua chiết pha rắn, ngoài tác dụng làm sạch có
thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu. Ngoài ra, người ta có thể sử dụng luồng
khí nóng để rửa giải các chất từ pha rắn, đây là cách thuận tiện để chuyển các
chất vào phân tích trên sắc ký khí [6], [10], [29].
Quá trình chiết pha rắn trải qua 4 giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp
chất và rửa giải [10].
- Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để làm ướt các
nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung
môi.

* Nền silica (SiO2).
Silica là một polymer vô cơ có cấu trúc chung là (SiO2)x, có thể được tạo
thành nhờ quá trình polymer hóa acid silicic. Bề mặt silica có chứa các nhóm
hydroxyl (-OH) và thường được gọi là nhóm silanol (SiOH).
Tùy theo đặc tính của pha liên kết mà có thể chia thành một số loại cột có
bản chất khác nhau, có thể kể ra bao gồm pha đảo, pha thuận và trao đổi ion.
- Pha đảo: Nền silica gắn thêm các nhóm không phân cực như C8, C18…
- Pha thuận: Nền silica gắn thêm các nhóm phân cực như –NH2, -CN,
diol…
- Trao đổi ion: Nền silica gắn thêm các nhóm trao đổi cation (dẫn chất
phenylsulfonic) hoặc anoin (dẫn chất amoni bậc 4).
* Florisil (Magnesi silicat)

8

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Magnesi silicat (MgSiO3) là các loại hạt có đường kính từ 25-200 µm kích
thước thông thường từ 60-100 µm. Đây là loại chất hấp phụ ít phân cực và tính
acid yếu hơn so với Silica. Vì có bản chất phân cực yếu nên Florisil thường được
dùng cho các HCBVTV rất phân cực, những chất mà không thể sử dụng cột
silica do liên kết quá mạnh với các nhóm silanol.
* Graphite cacbon (than chì)

- Các nền polymer chứa nhóm hoạt động
Gần đây, nhiều tác giả đã nghiên cứa phát triển để gắn các nhóm ưa nước
trên nền PS-DVB nhằm tăng tính chọn lọc và khả năng ứng dụng của loại cột
này. Điển hình nhất có thể kể đến là cột Oasis HLB.của Waters. HLB
(Hydrophilic Lipophilic Balance) có nghĩa là cân bằng thân nước, thân dầu. Loại
cột này được chế tạo bằng cách đồng trùng hợp N-vinylpyrrolydon và
divinylbenzen, trên bề mặt có hai vùng, một vùng thân nước và một vùng thân
dầu.
* Mixed mode.
Cột Mixed mode (tính năng trộn lẫn) là cột có nhiều cơ chế lưu gữ khác
nhau, nhằm đạt hiệu quả cao hơn trong quá trình làm sạch mẫu. Thông thường,
cột mixed-mode có hai cơ chế lưu giữ khác nhau.
* Ái lực miễn dịch.
Chiết bằng ái lực miễn dịch (IAC) dựa trên liên kết kháng nguyên – kháng
thể trong đó một loại imunoglobulin được dùng để gứn với chất phân tích. Bởi vì
imunoglobulin liên kết chọn lọc với chất kháng nguyên dùng để sản xuất ra nó
nên đây là kỹ thuật lý tưởng để phân tích chọn lọc một một chất hoặc một nhóm
chất nào đó. Ứng dụng của IAC còn khá hạn chế do kỹ thuật này có ứng dụng
hạn chế và khá tốn kém.

10

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng
cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân
không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn
(hội tụ). Mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định. Tỷ số m/z (hay còn
gọi là số khối) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Đây là
một thông số rất quan trọng trong định tính cũng như định lượng.
− Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ
được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ
trường để đi đến bộ phận phát hiện.
− Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch
đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
− Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

1 

3
2 

4

5

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển
ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước
đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous
Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS)
đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft
ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được
khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển
được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân
tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS:
•

Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI).

•

Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI).

•

Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photon
Ionization – APPI).

13

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM




Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
− SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò
để phát hiện.
− MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng
nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ
MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ
cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng
va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan
tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.2.3.Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ
Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà
khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành
phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong
dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản,
chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi
trường. Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định

nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng kích thích 278 nm và
bước sóng phát xạ 445 nm. Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến
106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [2].
Trong đề tài nghiên cứu về dư lượng kháng sinh Macrolides, Sulfonamides
và Trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kong, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử
dụng phương pháp LC/MS/MS với cột sắc ký YMC pro C18 (3 µm, 150 mm ×
2 mm), pha động là hệ: Dung dịch acid formic 1% - MeOH (1 % acid formic)
chạy gradient, với tốc độ dòng là 0,15 ml/phút. Mẫu nước sông được xử lý bằng
kỹ thuật chiết pha rắn với cột Oasis HLB (200mg, Water). Giới hạn định lượng
của phương pháp là từ 0,1 – 1,2 ng/ml [34].
Vishal et al cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dư lượng của các kháng
sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và

16

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM


WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ tại các thời điểm
khác nhau. Dư lượng ciprofloxacin được phát hiện là 2,20 – 236,6 µg/l và
norfloxacin là 6,4 – 29,6 µg/l. Một nghiên cứu khác cũng đã xây dựng phương
pháp để xác định các nhóm thuốc kháng sinh fluoroquinolon, sulfonamid,
trimethoprim, beta-lactam (penicillin và cephalosporin), nitroimidazol và
tetracyclin trong nước thải bệnh viện. Kết quả cho thấy nồng độ chất phân tích