BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ OANH
Mã sinh viên : 1201450

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA
TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP
MỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HÀ OANH
Mã sinh viên : 1201450

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA
TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP
MỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn :
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2.Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minh

Tổng quan về nhóm sulfonylurea ________________________________ 6
1.1.2.1 Glipizid ____________________________________________________________________ 6
1.1.2.2

Glimepirid _______________________________________________________________ 7

1.1.2.3

Gibenclamid _____________________________________________________________ 8

1.1.2.4

Gliclazid ________________________________________________________________ 9

Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu ___________________________ 9
1.2.1 Sắc ký lớp mỏng _________________________________________ 9
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ___________________ 15

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu ______________ 15
2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ______________________________________________ 15
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu _____________________________________________________ 15
2.1.3 Đối tượng nghiên cứu ___________________________________________________________ 16

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ___________________________________ 17
2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng glipizid, glimepirid, glibenclamid và gliclazid trộn lẫn trong
chế phẩm đông dược bằng HPTLC______________________________________________________ 17
2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu _________________________________________________ 17
2.2.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ___________________________________________ 17
2.2.2 Thẩm định phương pháp _________________________________________________________ 18
2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _________________________________ 20


CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN __________________________________________________ 42

4.1 Lựa chọn phƣơng pháp phân tích ____________________________ 42
4.2 Xây dựng phƣơng pháp ____________________________________ 43
4.2.1 Điều kiện xử lý mẫu_____________________________________________________________ 43

4.3 Thẩm định phƣơng pháp ___________________________________ 44
4.4 Về kết quả nghiên cứ trên mẫu thực__________________________ 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ _______________________________________________ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

1. Phụ lục 1
2. Phụ lục 2
1.1.

Sắc kí đồ analog đường tuyến tính Glipizid

1.2.

Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glimepirid

1.3.

Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glibenclamid

1.4.

Sắc kí đồ analog đường tuyến tính gliclazid


RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo ................................................................ 16
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết của 4 chất phân tích ........................................ 25
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC ................... 30
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của 4 chất phân tích .................................. 31
Bảng 3.5 Đánh giá kết quả độ lặp lại và độ đúng của 4 chất phân tích.............................. 32
Bảng 3.6 . Kết quả xác định LOD, LOQ của 4 chất phân tích ........................................... 36

nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên thế giới hướng tới. Tuy
nhiên, tình trạng tân dược được trộn trái phép trong đông dược, TPBVSK từ dược liệu
đang diễn ra (thành phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn) .
Đái tháo đường là một bệnh mạn tính và có thể gây tổn hại nghiêm trọng cho
nhiều hệ thống cơ thể trong một thời gian dài. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới và
khoảng 90% trong số đó là đái tháo đường typ II (không phụ thuộc insulin) [19].
Trên thị trường dược phẩm, bốn nhóm thuốc tổng hợp chính bao gồm: sulfonylure,
biguanid, thiazolidin và các thuốc khác không phải sulfonylure, được sử dụng phổ
biến để điều trị tiểu đường typ II. Đã có những nghiên cứu công bố thuốc giảm
glucose máu thường bị phát hiện trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược
như metformin, glibenclamid, gliclazid [15], [17]; ... Nếu sử dụng các chế phẩm
này trong một thời gian dài mà không biết rõ thành phần, liều lượng người sử
dụng có thể xuất hiện biểu hiện của tác dụng không mong muốn như nhiễm toan
lactic, tổn thương gan thận, rối loạn tiêu hóa…[20], [21]. Do đó, một nhu cầu cấp
thiết nhằm phát triển một phương pháp nhanh chóng để sàng lọc các chế phẩm
đông dược bị trộn lẫn các thuốc tân dược này.
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong các
chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp xác
định một số thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dƣợc
bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”.

1


Với mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, bước đầu định lượng các
thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc
ký lớp mỏng hiệu năng cao.
2. Ứng dụng phương pháp này để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược lưu


3


sử dụng thuốc thảo dược cho người mắc bệnh tiểu đường được khuyến khích bởi
những lo ngại về tác dụng phụ và chi phí liên quan tới việc sử dụng lâu dài các thuốc
tân dược. Ở Việt Nam, các thuốc đông dược và TPBVSK sử dụng hỗ trợ điều trị tiểu
đường rất đa dạng. Người bệnh có thể đến các nhà thuốc để mua các TPBVSK có số
đăng ký, được bào chế thành dạng viên nén, viên nang hoặc trà túi lọc thuận tiện cho
việc sử dụng. Trong khi đó, các chế phẩm thuốc đông dược của các lương y, lương
dược (không có số đăng ký) được bào chế dưới dạng viên hoàn hay thuốc bột ngoài
được bán tại cơ sở chế biến còn được bán trên các trang mạng xã hội, người bệnh
không cần đến tận nơi cũng có thể có được sản phẩm thuốc để sử dụng. Điều này vừa
có lợi vừa bất lợi cho người bệnh, khi những chế phẩm này chưa được kiểm soát chặt
chẽ có thể có những chế phẩm bị trộn lẫn tân dược mà người sử dụng không được biết.
Về thành phần của các thuốc đông dược và TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu đường
cũng rất đa dạng. Các chế phẩm có thể chỉ có 1 hoặc nhiều thành phần là dược liệu.
Các dược liệu phổ biến nhất được sử dụng trong các chế phẩm này là dây thìa canh,
khổ qua, nhàu, giảo cổ lam, sinh địa, hoài sơn…
Tuy thuốc từ thảo dược đã sử dụng lâu đời, nhưng người sử dụng có rất ít kiến
thức về tính an toàn của nó. Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực
phẩm sức khỏe, trong siêu thị và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng. Do
quy định thiếu chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng
trộn với thuốc tổng hợp không khai báo. Đây cũng là vấn đề mà các cơ quan chức
năng của nước ta cũng rất quan tâm. Trong những năm gần đây, cùng với sự phối hợp
của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa
phương đã phát hiện nhiều loại thuốc và chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược.
Trong đó bao gồm cả chế phẩm có và không có nguồn gốc, được sản xuất trong nước
hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là các chế phẩm không có số đăng ký. Các




Từ các nghiên cứu ở các nước trên thế giới, nhận thấy các thuốc nhóm
sulfonylurea như glibenclamid, gliclazid, glimepirid có thể được trộn vào các chế phẩm
đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường, để góp phần nghiên cứu đồng thời 4 hoạt chất
chống đái tháo đường nhóm sulfonyurea là glipizid, glimepirid, glibenclamid và
gliclazid, đề tài này đã được tiến hành.
Tổng quan về nhóm sulfonylurea
1.1.2.1 Glipizid
- Công thức cấu tạo: C21H27N5O4S

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Glipizid
Pyrazinecarboxamid,

N-[2-[4-[[[(cyclohexylamino)carbonyl]amino]sulfonyl]

phenyl]ethyl]-5-methy-1-cyclohexyl-3-[[p-[2(5-methylpyrazinecarboxamido)
ethyl]phenyl]sulfonyl]urea
-

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong
nước, ít tan trong ethanol. Tan ít trong methylclorid, aceton, methanol ..., hòa
tan tốt trong dung dịch kiềm và dimethylformanid.[2]

-

Liều dùng: Khởi đầu người lớn 5mg /ngày; người già hay người bệnh gan là 2,5
mg/ngày. Duy trì thường từ 15mg/ ngày, chia làm nhiều lần [5].

-

Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong
dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [2].

-

Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày. Duy trì 1-4mg/ ngày. Tối đa 8mg/ngày.

Tác dụng và cơ chế tác dụng: có tác dụng hạ glucose huyết, kích thích giải phóng
insulin từ tế bào beta tuyến tụy. Cơ chế: liên kết với thụ thể ở màng tế bào beta, làm
đóng các kênh Kali phụ thuộc lại, gây khử cực màng, làm kích thích mở kênh Calci.
Từ đó làm tăng nồng độ Calci trong tế bào, kích thích giải phóng insulin khỏi tế bào. Ở
ngoài tụy, glimepirid giúp cải thiện sự nhạy cảm của các mô ngoại vi với insulin và
làm giảm thu nạp insulin tại gan [5].

7


-

Tác dụng không mong muốn: tác dụng không mong muốn quan trọng nhất là tụt
glucose huyết, ngoài ra gây cảm giác chóng mặt, nhức đầu, buồn nôn, nôn, tiêu
chảy, đau bụng [5].

1.1.2.3 Gibenclamid
Công thức hoá học: C23H28ClN3O5S

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glibenclamid
Tên khoa học:

1 – (4 – (2 – (5 – cloro – 2 – methoxybenzamido) ethyl)

Tên khoa học: 1– (azabicyclo (3,3,0) oct–3–yl)– 3-p-tolylsulfonylure [6]
-

Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan,
hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% [4], [6].

-

Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80 mg/ngày
và tối đa là 320 mg/ngày [6].

-

Tác dụng và cơ chế tác dụng: kích thích tế bào beta tuyến tụy giải phóng insulin,
do vậy thuốc chỉ có tác dụng trên người bệnh còn có khả năng sản xuất insulin.

-

Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, nôn đau đầu, phát
ban. [5]

Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu
1.2.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát triển từ lâu. Lớp
mỏng kết dính là pha tĩnh. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30 µm được
rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng
thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn
chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất

9

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC. HPTLC
được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp
lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi
lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phun mẫu,
khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động,
giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu được
tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời
có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong
quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ
lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí
nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp
phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [9].
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng
hiệu năng cao (high performance plates). Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn
TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn.
Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ
phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung
môi ít hơn so với TLC [9].
Ƣu điểm của HPTLC:
- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.
- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết
kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.

11


- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại
cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích.

(glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin,
gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30
mẫu thu thập từ thị trường. Lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,88 mg/viên
đến 6,78 mg/viên.
Wensheng Pang [17] đã tiến hành phát hiện và xác định cấu trúc của các thuốc hạ
đường huyết tổng hợp thêm trái phép vào các sản phẩm thuốc từ thảo dược để chống
bệnh tiểu đường bằng phương pháp LC-MS-MS, phân tích theo chế độ MRM. Các
mẫu dạng viên nén hoặc nang được nghiền thành bột, sau đó chiết siêu âm với
methanol (2 lần x 100 ml; 20 phút mỗi lần); gộp dịch chiết và ly tâm 10 phút, gạn dịch
và chuyển sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch bằng methanol; 1ml dung
dịch này được chuyển sang bình định mức 10ml và pha loãng đến vạch bằng methanol.
Sử dụng cột C18 (2,1mm x 150mm, 5µm); pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung
dịch acid formic 0,05% trong nước tỷ lệ 60:40; tốc độ dòng 0,2 ml/phút tại 40,7 bar;
thể tích tiêm 10 µl. Trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc phát hiện
thấy có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, và 3 thuốc chứa phenformin, hai
thuốc khác chứa glimepirid và metformin. Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay
đổi từ 0,28 mg/viên đến 4,9 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 1,56 mg
đến 29,4 mg.
Mei Cui [11] sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp với DAD để
xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp trong các thuốc cổ
truyền của Trung Quốc. Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên và thuốc

13


hạt được nghiền thành bột đồng nhất. Lượng bột tương đương 1 liều dùng được cho
vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml methanol, chiết siêu âm trong 20 phút, pha loãng
đến vạch bằng methanol. Việc tách được thực hiện trên cột C18 với pha động gồm
acetonitril và dung dịch chứa 1,0 mmol natri dodecyl sulfat và triethylamin 0,1% (sử
dụng acid phosphoric điều chỉnh tới pH 3,75), tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo

hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính.
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck (Đức).
- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức).
- Máy lắc xoáy Labinco BV L46..
- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức).
- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản).

15


- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc).
- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, bình chiết, pipet ...
2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu thử: 40 chế phẩm đông dược và TPBVSK dạng bào chế viên nén, viên nang
cứng và viên hoàn có chỉ định điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tiểu đường đang lưu hành
trên thị trường, được mua tại các nhà thuốc, mua qua các trang mạng internet, của các
lương y hoặc do người dùng nghi ngờ yêu cầu kiểm tra.
- Nền mẫu tự tạo: mẫu bột mịn tự tạo từ 18 vị dược liệu đại diện cho các vị dược liệu
có trong 40 mẫu chế phẩm đông dược, TPBVSK có mặt trên thị trường.
Bảng 3.1. Thành phần nền mẫu dược liệu tự tạo
Dây thìa canh

6g

Mướp đắng

6g

Giảo cổ lam


Trạch tả

2g

Quế chi

2g

Sơn thù

2g

Hoài sơn

1g

Sinh địa

5g

Phụ tử

2g

Tan diệp

2g

Ngưu tất