BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

DS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
LC-MS/MS ĐỊNH LƢỢNG
METHYLPREDNISOLON TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

DS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
LC-MS/MS ĐỊNH LƢỢNG
METHYLPREDNISOLON TRONG HUYẾT
TƢƠNG NGƢỜI



MỤC LỤC
Danh mục k hiệu chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1.
PHÂN TÍCH THUỐC TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG LCMS/MS ................................................................................................................... 3
1.1.1. Kỹ thuật xử l mẫu : ............................................................................ 3
1.1.2. Kỹ thuật phân tích LC-MS/MS: .......................................................... 4
1.1.3. Các yêu cầu, chỉ tiêu thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân
tích thuốc trong dịch sinh học: ........................................................................... 7
1.2.
MPN VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG HUYẾT
TƢƠNG ............................................................................................................... 10
1.2.1. Tổng quan về MPN : ......................................................................... 10
1.2.2. Các phương pháp phân tích MPN trong huyết tương : ..................... 12
Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................16
2.1.
NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU .................... 16
2.2.
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 17
2.3.
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 17
2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích : ................................................... 17
2.3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định MPN và chuẩn nội : ...... 17
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc k :............................................................ 18
2.3.1.3. Khảo sát quy trình xử l mẫu huyết tương : ................................. 18

3.2.6.3. Độ ổn định của mẫu sau xử l (trong autosampler) :.................... 45
3.2.6.4. Độ ổn định dài ngày: ..................................................................... 46
3.3.
ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỊNH LƢỢNG
MPN TRÊN MẪU TĐSH VIÊN NÉN MPN.................................................... 47
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ............................................................................................... 51
4.1.
Phương pháp xử l mẫu : ......................................................................... 51
4.2.
Phương pháp phân tích MPN trong huyết tương người : ........................ 52
4.3.
Về áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng MPN trên mẫu
TĐSH của viên nén MPN 16mg: ......................................................................... 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................55
I. KẾT LUẬN: .............................................................................................................55
1.
Về xây dựng phƣơng pháp phân tích:.................................................. 55
2.
Về thẩm định phƣơng pháp phân tích: ................................................ 55
3.
Ứng dụng phƣơng pháp trên mẫu thử TĐSH viên nén MPN 16mg: 55
II. KIẾN NGHỊ .............................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 57


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA
: Phân tích phương sai (Analysis of Variance)
AUC
: Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve)

: Khối phổ (Mass Spectrometry)
NTN
: Người tình nguyện
RSD
: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
SD
: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
SKD
: Sinh khả dụng
TĐSH : Tương đương sinh học
Tmax
: Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa
ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper limit of Quantification)
US-FDA : Cục quản l thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food
and Drug Admistration)
USP
: Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia)
Xtb
: Trung bình


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Tên bảng

STT

Trang

1


6

Bảng 3.4: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời
gian lưu của MPN

35

7
8

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời
gian lưu của IS

37
37

Bảng 3.7: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
Bảng 3.8: Sự tương quan giữa nồng độ MPN trong huyết
tương và tỷ lệ đáp ứng pic MPN/IS

38

11

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày

40

12

chứng (B) 16 mg MPN

49

20

Bảng 3.18: Các thông số dược động học của MPN trên người
tình nguyện sau uống viên nén MPN 16 mg

50

9
10

14
15
16
17

39

43

45
46


DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN
STT


Hình 3.3: Giản đồ cường độ tín hiệu của các mảnh ion con
tạo thành từ [MPN-H]+

25

6

7

8

Hình 3.4: Phổ khối khi phân tích mảnh [MPN-H]+ ở mức thế
20 V
Hình 3.5: Sắc k đồ của MPN và IS với các hệ pha động
methanol - acid formic 0,1% (90-10) (a); methanol – amonia
cetat 2 mM (90-10) (b); acetonitril – amoni acetat 2 mM có tỷ
lệ (50-50) (c) và (70-30) (d)
Hình 3.6: Sắc k đồ của MPN và IS với các hệ pha động
acetonitril - amoni acetat 2 mM (90-10): (e)

26

28

28

9

Hình 3.7: Sắc k đồ mẫu huyết tương trắng khi tủa protein
bằng acetonitril (a) và methanol (b)

chứng.

35
36
36

48



ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nước ta hiện nay việc nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và
tương đương sinh học (TĐSH) đã được thực hiện khá phổ biến nhằm đảm bảo
tính an toàn và hiệu quả của thuốc được lưu hành trong nước. Hiện nay nhà
nước đã ban hành các quy chế quy định về nghiên cứu SKD hoặc TĐSH
như: Quy định đối với thuốc mới hồ sơ đăng k phải có đầy đủ kết quả nghiên
cứu SKD [3], đối với thuốc generic thì có quy định danh mục các thuốc phải
đánh giá TĐSH [4].
Methylprednisolon (MPN) là thuốc chống viêm, chống dị ứng thuộc
nhóm glucocorticoid, đây là một thuốc có nhu cầu sử dụng khá lớn do Việt Nam
có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm nên số người mắc các bệnh về khớp, dị
ứng chiếm tỷ lệ cao. Methylprednisolon được sản xuất dưới nhiều dạng bào chế,
ngoài các thuốc bột đông khô pha tiêm, còn có một số lượng lớn các chế phẩm
viên nén 4 mg, 16 mg. Theo thống kê của Cục quản l Dược cuối năm 2016 có
tới hơn 50 số đăng k các chế phẩm viên nén methylprednisolon hàm lượng 4
mg , 16 mg do các doanh nghiệp dược Việt Nam, Ấn độ, Hàn Quốc ... sản xuất.
Đại đa số các chế phẩm viên nén đang lưu hành trên thị trường Việt Nam đều
chưa có các nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH với thuốc đối chứng. Do vậy, cần
thiết phải thực hiện các nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH các thuốc này để nâng
cao chất lượng thuốc sản xuất và lưu hành trên thị trường Việt Nam, thực hiện


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. PHÂN TÍCH THUỐC TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG LC-MS/MS
1.1.1. Kỹ thuật xử lý mẫu :
Để thực hiện các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH của thuốc một
trong những nội dung rất quan trọng là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách,
xử l mẫu trong dịch sinh học.
a) Chiết lỏng – lỏng:
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong
một dung môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ
nhất. Trong thực tế thường dùng hai pha nước – dung môi hữu cơ không tan
trong nước để chiết tách. Các chất được chuyển giữa 2 pha có thể thuộc nhiều
loại hình hóa học khác nhau, bao gồm:
 Các chất dạng acid, base hoặc lưỡng tính.
 Các chất dạng nội phức.
 Cặp ion.
Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và được sử dụng phổ
biến nhất trong các phương pháp xử l mẫu có nền mẫu tương đối phức
tạp. Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng nhiều dung môi,
khó kết nối với các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm
sai lệch kết quả
b) Chiết pha rắn (SPE):
Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha
lỏng và rắn, trong đó chất phân tích được chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau đó
rửa giải bằng dung môi thích hợp. Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục được
các nhược điểm của chiết lỏng – lỏng. Lượng dung môi sử dụng ít, dịch chiết dễ
xử l khi kết nối GC, HPLC, khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là
cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy
nhiên có nhược điểm là khó lưu giữ chất phân cực mạnh, khó xây dựng được
quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm nhiều nhưng vẫn còn lớn, giá

4


b) Mặt phân giới ion hóa (ionzation interface):
Có vai trò loại bỏ dung môi pha động không cho vào MS: Các chất
không ion hóa bị chệch hướng ra ngoài không qua được lỗ nhỏ vào MS, hoặc sử
dụng khí chắn để đuổi dung môi.
Ion hóa mẫu: Chất phân tích được ion hóa thành ion dương hoặc ion âm
để đi vào MS. Có 2 kiểu tạo ion phổ biến: ion hóa bằng dòng điện tử (electron
spray ionization – ESI) và ion hóa bằng dòng ion (ion spray ionaziation – ISI)
còn được gọi với tên khác ion hóa hóa học (atmospheric – pressure chemical
ionization – APIC). EIS thường được áp dụng cho các chất phân cực mạnh hoặc
ở dạng ion. APIC thường áp dụng cho các chất ít phân cực hơn.
c) Khối phổ (MS) - có 3 loại MS cơ bản:
 Tứ cực (quadrupole): Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng
tới detector, những ion khác bị phá hủy do va đập vào tứ cực.
 Bẫy ion (ion trap): Tất cả các ion di chuyển theo hình xoắn ốc,
nhưng ion phù hợp với tần số quét RF đi vào các lỗ nhỏ (bẫy ion).
 Ống đo thời gian bay (time – of – flight tube): Các ion có số khối
khác nhau được phân tách theo thời gian bay.
Việc kết hợp 2 hay nhiều loại trên với nhau tạo thành hệ thống MS/MS
lai như: Triple – quadrupole hoặc tandem mass spectrometer, Q-Tof, ... Máy
phân tích MS/MS thường kết hợp 2 máy phân tích có tế bào va đập (a collision
cell). Ion đích được lựa chọn từ máy phân tích MS đầu tiên được va đập với
phân tử khí trơ tạo thành các ion phân mảnh, rồi đi vào trong máy phân tích MS
thứ 2.
Detector (bộ phận phát hiện): Sau khi đi ra khỏi bộ phân tích khối lượng,
các ion được đưa tới bộ phận phát hiện ion. Từ đó hệ thống dữ liệu ghi nhận tất
cả các thông tin về phổ từ sắc k đồ chạy ở dạng khối dữ liệu 3 chiều [2].
Trong số các phương pháp LC-MS, phương pháp sắc k lỏng hiệu năng

tiếp tục được phân tích khối và tách riêng thành từng loại theo số khối tại Q3.
6


Các hợp chất cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ
chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy có
thể định tính định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp MS.
Trong phương pháp MS, để định tính một chất có thể tiến hành theo cách: so
sánh phổ khối của chất cần phân tích với phổ khối chuẩn trong thư viện phổ. Để
định lượng, xác định nồng độ / hàm lượng của hoạt chất, có thể lựa chọn một
hoặc một vài số khối đặc trưng cho hoạt chất cần phân tích, thường chỉ lựa chọn
một số khối đặc trưng và có đáp ứng ổn định nhất trong quá trình phân tích (có
thể là ion mẹ - phương pháp MS) hoặc một ion con (phương pháp MS/MS) và
tiến hành so sánh cường độ số khối này trong mẫu thử với cường độ của nó
trong một hoặc nhiều mẫu chuẩn (mẫu chứa chất chuẩn) đã biết nồng độ hàm
lượng [9].
1.1.3. Các yêu cầu, chỉ tiêu thẩm định phƣơng pháp LC-MS/MS phân tích
thuốc trong dịch sinh học:
Thẩm định là quá trình nghiên cứu thực nghiệm xác định những đặc
điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đạt yêu cầu với các
ứng dụng phân tích thực tế và chứng minh phương pháp có đủ độ nhạy, độ tin
cậy để phân tích những mẫu thực.
Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ
chất phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải
được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu. Nội dung thẩm định
phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được qui định
trong các dược điển [13] [14][15][17] bao gồm các tiêu chí sau:
 Tính chọn lọc - đặc hiệu (Selectivity – Specificity):
Tính chọn lọc, hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng
chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể là chất phân hủy, tạp

Độ đúng của phương pháp là sự sai khác giữa nồng độ định lượng được
và nồng độ thực của chất cần phân tích. Có nhiều phương pháp xác định độ
đúng, được sử dụng nhiều nhất là phương pháp thêm chính xác lượng chuẩn vào
mẫu thử và đánh giá khả năng tìm lại tương đối. Giá trị này phải nằm trong
khoảng 85 – 115%, có thể là 80 – 120% đối với điểm gần giới hạn định lượng.
Độ chính xác của phương pháp là mức độ thống nhất giữa các kết quả
riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng
nhất. Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp được xác định bằng
độ lặp lại (repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác
ngày). Phương pháp xác định là thực hiện phân tích trên một mẫu thử đồng nhất
n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong một thời điểm khác ngày. Xác định độ lệch

8


chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần thử. Nói chung, RSD không nên vượt quá
15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.
 Tỷ lệ thu hồi (Recovery):
Tỷ lệ thu hồi dược chất sau khi mẫu được chiết tách theo qui trình đã
chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử l qua chiết tách (mẫu pha
trong pha động). Về mặt l thuyết chỉ tiêu này không bắt buộc phải đánh giá.
Tuy nhiên, nên tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi đặc biệt với các trường hợp xử l
mẫu bằng chiết lỏng – lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE). Để xác định tỷ lệ thu hồi
của phương pháp nên tiến hành trên 3 mẫu có nồng độ nằm trong khoảng đường
chuẩn đã khảo sát, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần. Tỷ lệ thu hồi không nên
vượt quá 110% và không nên quá thấp. Giá trị RSD < 15% đối với mỗi nồng độ
và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15%.
 Độ ổn định (Stability of the samplers):
Quá trình phân tích đánh giá SKD và TĐSH thường kéo dài vì số lượng
mẫu lớn. Do vậy, các tài liệu đều hướng dẫn nghiên cứu độ ổn định của chất cần

tan trong ethanol, tan nhẹ trong aceton, khó tan trong dioxan và methylen
clorid.
 Mảnh khối phổ (m/z): 375,4 (ion phân tử, mảnh mẹ), 160,8 (mảnh phổ con)
[27]
a) Dược l và cơ chế tác dụng:
 MPN có tác dụng trên chuyển hóa glucid, protid, lipid và chuyển hóa muối
nước. Tác dụng trên các cơ quan và tuyến, thần kinh trung ương, tiêu hóa,
trên máu và tổ chức hạt.
 Tác dụng chính là tác dụng chống viêm và chống dị ứng:
 Tác dụng chống viêm: Do thuốc ức chế phospholipase A2 thông qua kích
thích tổng hợp lipocortin, làm giảm tổng hợp cả leucotrien và
prostaglandin. Ngoài ra nó còn có tác dụng ức chế dòng bạch cầu đơn nhân,
đa nhân, lympho bào đi vào mô để gây khởi phát phản ứng viêm. Vì vậy
thuốc có tác dụng chống viêm do mọi nguyên nhân (cơ học, hóa học, miễn
dịch và nhiễm khuẩn).

10


 Tác dụng chống dị ứng: Thuốc ức chế phospholipase C (là chất xúc tác cho
quá trình giải phóng ra các chất trung gian của phản ứng dị ứng như
histamin...) do đó làm giảm giải phóng các chất trung gian hoá học gây dị
ứng. Vì vậy thuốc có tác dụng chống dị ứng [11].
b) Chỉ định và chống chỉ định:
 Chỉ định: Chống viêm và giảm miễn dịch trong viêm khớp dạng thấp, lupus
ban đỏ toàn thân, viêm mạch, viêm đại tràng mạn...
 Chống chỉ định và thận trọng: Nhiễm khuẩn nặng, trừ sốc nhiễm khuẩn và
lao màng não; nhiễm nấm hoặc lao, virus; đang dùng vaccin virus sống,
loét dạ dày, tá tràng, đái tháo đường, rối loạn tâm thần, tăng huyết áp [5].
c) Dược động học:

66,58 ±
13,88

2,25 ±
0,73

342,53 ±
90,38

2,19 ±
0,43

[27]

Viên nén thường 16 mg,
dùng 1 liều duy nhất (n=20)

129,6

2,05

650,0 ±
168,0

2,15 ±
0,36

[21]

Viên nén (liều 4 x 5 mg = 20


3,68 ±
0,49

[23]

Trên thị trường hiện nay có các loại viên nén hàm lượng 4 mg, 16 mg...
Theo các nhiều nhà sản xuất liều dùng bắt đầu thường là 4 - 48 mg mỗi ngày,

11


tùy loại bệnh có thể dùng liều tối đa là 100 mg, sau khi uống khoảng 2 giờ MPN
đạt cực đại. Thời gian bán thải khoảng 2 - 4 giờ với người bình thường [25].
Trong nghiên cứu SKD và TĐSH, thời gian lấy mẫu phải đảm bảo xây
dựng được đường cong biểu diễn nồng độ thuốc/máu theo thời gian một cách
đầy đủ và phù hợp. Thời gian lấy máu thường kéo dài 3-5 t1/2 (khi đó có tới 90 %
thuốc đã được đào thải). Đối với khi nghiên cứu đa liều thời gian lấy máu bằng
khoảng liều thực tế dùng thuốc. Tham khảo một số nghiên cứu thời gian lấy máu
NTN khi dùng viên nén thường 8 mg kéo dài 16 giờ [25] hoặc viên nén hàm
lượng 32 mg kéo dài 24 giờ [23]. Phương pháp phân tích MPN trong dịch sinh
học cần có độ nhạy khoảng 2-3 ng/ml (1/20 Cmax) để đảm bảo thu được giá trị
AUC0-t > 80 % AUC0-∞ [25].
1.2.2. Các phƣơng pháp phân tích MPN trong huyết tƣơng :
Có nhiều phương pháp đã được sử dụng để phân tích MPN, mỗi phương
pháp đều có những ưu nhược điểm riêng và được ứng dụng trong những trường
hợp nhất định. Tùy theo từng loại mẫu mà lựa chọn phương pháp phân tích phù
hợp.
 Định lượng MPN trong nguyên liệu và chế phẩm:
Yêu cầu phương pháp có độ nhạy vừa phải, nên chỉ cần phương pháp


LLOQ
(ng/ml)

[21] Chiết lỏng-lỏng HPLC- Triamcinolon
8,5
25,0
với dung môi
UV
ethyl acetat
[25] Chiết lỏng-lỏng HPLC13,0
2,5
với dung môi
UV
tert-butyl methyl
ether
[23] Chiết lỏng-lỏng
LCBudesonid
2,8
10,1
với dung môi MS/MS
tert-butyl methyl
ether
[22] Chiết lỏng-lỏng
LCTriamcinolon
4,0
20,0
với dung môi MS/MS acetonid
tert-butyl methyl
ether

Phương pháp LC/MS/MS [22] của Shuang-Qing Zhang và các cộng sự
có LLOQ là 20 ng/ml chưa thích hợp để phân tích các mẫu cần độ nhạy thấp,
thời gian phân tích mẫu là 4 phút, xử l mẫu bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng
bằng tert-butyl methyl ether đơn giản, tuy nhiên độ thu hồi thấp từ 76,8% đến
79,2%.
Phương pháp LC/MS/MS [27] của Xingjiang Hu và các cộng sự có độ
giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là 5,25 ng/ml, thời gian phân tích mẫu tương
đối ngắn. Tuy nhiên phương pháp này lại xử l mẫu bằng cách tủa protein sau
đó chiết pha rắn, thời gian xử l mẫu tương đối dài, pha rắn chiết tự động và kết
nối bộ phân tích nên chi phí cao đồng thời hiện nay có ít phòng thí nghiệm được
trang bị bộ chiết pha rắn.
Đặc thù của nghiên cứu SKD và TĐSH là mẫu phức tạp, lẫn nhiều tạp
chất, nồng độ dược chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên các
phương pháp phân tích MPN trong dịch sinh học có các yêu cầu cơ bản sau:
 Tính đặc hiệu cao: Phân biệt được MPN với các tạp chất lẫn trong mẫu
và các chất có công thức gần giống với MPN. Nên yêu cầu phương pháp
xử l mẫu phải loại được hầu hết các tạp chất, độ tinh sạch cao nhưng cần
đơn giản, dễ thực hiện và tốn ít thời gian do lượng mẫu trong các nghiên
cứu SKD và TĐSH là rất lớn.
 Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ) thấp: Khoảng liều dùng của MPN
viên nén là 4 - 48 mg mỗi ngày. Nồng độ thuốc MPN trong dịch sinh học
thấp cần phương pháp có độ nhạy khoảng 2 - 3 ng/ml (1/20 Cmax).

14


 Thời gian phân tích mẫu ngắn: Số lượng mẫu phân tích trong đánh giá
TĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnh hưởng tới kết
quả phân tích.
 Độ nhạy: Phương pháp phân tích MPN trong dịch sinh học cần có độ

 Thiết bị, dụng cụ:
Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo qui định của
ISO/IEC 17025-2005 và GLP, bao gồm:
+ Hệ thống LC-MS loại Triple Quadrupole, model TSQ Quantum Ultra
với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt – HESI, Thermo
Fisher Scientific;
+ Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg);
+ Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2-16K;
+ Thiết bị bay hơi dung môi Reacti-Therm III, Thermo scientific;
+ Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific;
+ Tủ lạnh sâu -35 ± 50C, Sanyo MDF-236;

16