BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU
TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV
(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU
TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV
(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành: Kỹ thuật Trồng trọt
Mã số:

60.62.01


chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Thị Tuyết Phượng

iii


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông học,
Phòng Sau đại học Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện trong thời gian học tập. Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp
Trường Đại học Tiền Giang đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí trong quá trình
học tập. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Nghiên cứu Công nghệ
Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện trong quá trình làm đề tài. Quý Thầy Cô
trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập tại trường.
Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS.TS. Dương Tấn Nhựt, TS. Bùi Minh
Trí, những người Thầy luôn tận tụy và giàu lòng hy sinh cho sự nghiệp trồng người.
Một tấm gương lao động cần mẫn và hết lòng đam mê khoa học. Cám ơn Quý Thầy
đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ kinh phí cho em trong
quá trình làm đề tài. Cám ơn Quý Thầy đã cho em có cơ hội tiếp xúc với môi trường
nghiên cứu khoa học mà em từng mơ ước được một lần đến. Cám ơn Quý Thầy đã
là điểm tựa và chấp cánh cho em để ngày càng được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cám ơn PGS.TS. Lê Quang Hưng, TS. Võ Thái Dân đã tận
tình chỉ dẫn giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Con xin cám ơn Ba Mẹ, các Chị đã hết lòng thương yêu, đùm bọc, dìu dắt con
trong cuộc đời. Cám ơn các Anh Chị Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống
cây trồng, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ trong quá trình làm đề
tài. Em xin cám ơn thầy Phạm S, thầy Tuấn, chú Tới, chú Xuân Tùng, cô Toản, cô
Hương, cô Lan, chị Hằng; anh Nam, Công, Hùng, Dũng, Tâm, Sơn; bạn Trang,
Tâm, Công; em Thùy, Sương, Bá Nam, Tuấn, Thái, Dung, Chương, Nam, Diệu

IBA, 0,75 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong giai
đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm. Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi
được trồng ra vườn ươm 45 ngày của ba giống dâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu
Pháp bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu được kiểm tra đều
không bị nhiễm virus SCV.

v


SUMMARY
The thesis “Improving SCV-free strawberry (Fragaria spp.) propagation
protocol through tissue culture method”, was carried out at Department of Plant
Molecular Biology and Plant Breeding, Tay Nguyen Institute of Biology;
Department of Plant Bioteachnology, Research Institute for Biotechnology and
Environment from 10/2008 to 10/2009. Experiments were arranged in Completely
Randomized Design with three replications. The shoot regeneration from leaf
tissues of in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da,
My Huong and Phap, depended on different genotypes and supplemented TDZ
concentrations. My Huong showed the highest regeneration rate among the three
strawberry cultivars. The highest shoot regeneration rate from leaf tissues of in vitro
strawberry plantlets was noticed after leaf tissues had been cultivated on MS
medium containing 1 mgl-1 TDZ, 0.1 mgl-1 NAA, 30 gl-1 sucrose and 8 gl-1 agar.
“Leaves cutting and shoot tip wounding” treatment performed significantly higher
shoot regeneration rate compared with “No cutting” and “Leaves cutting”
treatments. By supplementing sucrose to growing medium, the growth of in vitro
strawberry plantlets were improved and the concentration of 30 gl-1 sucrose showed
the optimal growth for in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars. ½
MS medium supplemented with 30 gl-1 sucrose, 0.2 mgl-1 IBA, 0.75 gl-1 activated
charcoal and 8 gl-1 agar was the most suitable for the development of in vitro
strawberry plantlets. After 45 days in nethouse condition, strawberry plantlets of

1.2.3 Yêu cầu của đề tài ..............................................................................................3
1.3 Giới hạn của đề tài ................................................................................................3
1.3.1 Thời gian nghiên cứu .........................................................................................3
1.3.2 Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................................4
2.1 Sơ lược về cây dâu tây ..........................................................................................4
2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây ...................................................................4
2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây dâu tây ................................................................5
2.1.2.1 Nguồn gốc .......................................................................................................5

vii


2.1.2.2 Phân bố ............................................................................................................5
2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây dâu tây................................................................5
2.1.4 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây .........................................................6
2.1.5 Thành phần các chất có trong quả dâu tây .........................................................6
2.1.6 Công dụng của cây dâu tây ................................................................................7
2.1.7 Điều kiện canh tác của cây dâu tây ....................................................................7
2.1.7.1 Đất trồng..........................................................................................................7
2.1.7.2 Khí hậu ............................................................................................................7
2.1.8 Tình hình canh tác cây dâu tây...........................................................................7
2.1.8.1 Trên thế giới ....................................................................................................7
2.1.8.2 Ở Việt Nam .....................................................................................................8
2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật .........................................................................13
2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật ...........................................................................13
2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........................................................13
2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .............................................................................13
2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo ............................................................................................14
2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn ......................................................................................14

2.4.5.1 Kỹ thuật lai phân tử (Molecular hybridization) ............................................25
2.4.5.2 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ............................................................................25
2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR .............................................................25
2.5.1 Kỹ thuật PCR ...................................................................................................25
2.5.2 Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................................26
2.6 Sơ lược về virus SCV gây hại trên cây dâu tây ..................................................27
2.6.1 Phân loại ...........................................................................................................27
2.6.2 Nguồn gốc - phân bố ........................................................................................27
2.6.3 Hình dạng - kích thước.....................................................................................27
2.6.4 Genome ............................................................................................................27
2.6.5 Protein ..............................................................................................................27
2.6.6 Phạm vi ký chủ .................................................................................................27
2.6.7 Phương thức lan truyền ....................................................................................27
2.6.8 Triệu chứng và tác hại của virus SCV trên cây dâu tây ...................................28
2.6.8.1 Triệu chứng ...................................................................................................28

ix


2.6.8.2 Tác hại của virus SCV...................................................................................28
2.6.9 Biện pháp quản lý virus SCV ...........................................................................28
2.6.10 Một số nghiên cứu về virus SCV ...................................................................28
2.6.10.1 Trên thế giới ................................................................................................28
2.6.10.2 Ở Việt Nam .................................................................................................29
2.7 Một số thành tựu trong việc tạo cây sạch bệnh virus bằng phương pháp nuôi cấy
mô ..............................................................................................................................33
2.7.1 Trên thế giới .....................................................................................................33
2.7.2 Ở Việt Nam ......................................................................................................33
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................34
3.1 Thời gian nghiên cứu ..........................................................................................34

3.4.3.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................44
3.4.3.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................44
3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong
giai đoạn nuôi cấy in vitro sự lên sinh trưởng của cây dâu tây sau khi đượctrồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................45
3.4.4.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................45
3.4.4.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................45
3.4.4.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................46
3. 4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi ...........................................................................................46
3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................47
3.4.5.1 Điều kiện thí nghiệm .....................................................................................47
3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................48
3.4.5.3 Phương pháp tiến hành ..................................................................................48
3.4.5.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................54
3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................................54
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................58
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp
với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro.........................58
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy
lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro ..............................67

xi


4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự
sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro.................................................76
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong
giai đoạn nuôi cấy in vitro lên sự sinh trưởng của cây dâu tây sau khi được trồng ra
vườn ươm ..................................................................................................................83


Complementary deoxyribonucleic acid

DNA:

Deoxyribonucleic acid

DAS-ELISA:

Direct double antibody sandwich ELISA

DEPC:

Diethyl pyrocarbonate

dNTP:

Deoxyribo nucleic acid triphosphate

EDTA:

Disodium ethylenedia minetera acetate

ELISA:

Enzyme linked immunosorbent assay

EL:

Elution

MS:

Murashige and Skoog

N:

Negative (Đối chứng âm)

NC

No cutting

ns:

Non signification

NSC:

Ngày sau cấy

xiii


NT:

Nghiệm thức

P:

dâu Pháp


Trung bình

TBE:

Tris base, Boric acid, EDTA

Tm:

Melting temperature

TGPSC:

Thời gian phát sinh chồi

TLPSC:

Tỷ lệ phát sinh chồi

TLS:

Tỷ lệ sống

TLT:

Trọng lượng tươi

TLK:

Trọng lượng khô


microlit

mM

miliMol

µM:

microMol

pmol:

picromol

Ø:

Đường kính

xiv


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Cây dâu tây (Fragaria spp.) .................................................................. 4
Hình 2.2 Hình dạng trái dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở
Đà Lạt ...................................................................................................... 10

½ MS với các nồng độ sucrose khác nhau ............................................... 82
Hình 4.11 Giải phẫu mô lá cây dâu tây in vitro (xem dưới kính hiển vi điện tử
40X) ......................................................................................................... 82
Hình 4.12 Hình dạng khí khổng của lá cây dâu tây in vitro Mỹ Hương
sau khi được nuôi cấy 45 ngày trên môi trường không có sucrose
(xem dưới kính hiển vi điện tử 40X) ....................................................... 89
Hình 4.13 Cây dâu tây cấy mô của ba giống dâu tây ứng với các nồng độ sucrose
khác nhau trong giai đoạn nuôi cấy in vitro được trồng ra vườn ươm .... 89
Hình 4.14 Cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày........... 90
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩn PCR trong kiểm tra virus SCV trên cây
dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày ................................... 92
Hình 4.16 Cây dâu tây Mỹ Hương được nuôi cấy trên môi trường có các nồng
độ sucrose khác nhau trong giai đoạn ra rễ in vitro sau khi được trồng
ra vườn ươm 45 ngày ............................................................................... 93
Hình 4.17 Cây dâu tây được dùng để kiểm tra virus SCV ................................... 93
Hình 4.18 Lá cây dâu tây được dùng để ly trích RNA ......................................... 93
Hình 4.19 Các bước thực hiện trong kiểm tra virus SCV bằng kỹ thuật RT-PCR 94
Hình 4.20 Cây dâu tây sạch virus SCV được tiếp tục chăm sóc ở vườn ươm ..... 94
Hình 5.1 Quy trình nhân giống cây dâu tây sạch virus SCV bằng phương pháp
nuôi cấy mô ............................................................................................... 96

xvi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 Thành phần các chất có trong quả dâu tây ..................................................6

phát sinh 45 ngày từ mô lá ...........................................................................63
Bảng 4.6 Thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi
được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ..........................................67
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên thời gian
phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi được phát
sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ...........................................................68
Bảng 4.8 Chiều cao, số lá, kích thước lá, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ
lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày trong điều
kiện in vitro ..................................................................................................69
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên chiều cao
chồi, số lá, kích thước lá của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45
ngày trong điều kiện in vitro ........................................................................71
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên trọng
lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi
được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro ..........................................71
Bảng 4.11 Chiều cao cây, số lá, kích thước lá, số rễ và chiều dài rễ của cây dâu
tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ..................................................76
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên chiều cao cây,
số lá, kích thước lá của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45
ngày ..............................................................................................................77
Bảng 4.13 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên số rễ và chiều
dài rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ....................78
Bảng 4.14 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây
in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày ........................................................79
Bảng 4.15 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên trọng lượng tươi,
trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây in vitro sau khi được
nuôi cấy 45 ngày ..........................................................................................80

xviii



Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Cây dâu tây (Fragaria spp.) là loại cây ăn quả giàu dinh dưỡng. Quả dâu tây
cung cấp nhiều loại chất khoáng như Ca, K, P, Mg, Fe và nhiều vitamin cần thiết
cho cơ thể con người như vitamin A, vitamin B và vitamin C (Đỗ Huy Bích và ctv.,
2004). Trong quả dâu tây còn có chất fisetin, có tác dụng chống oxy hóa, giúp bảo
vệ tế bào khỏi bị lão hóa (Lê Kim Phụng, 2007). Quả dâu tây còn cung cấp ellagic
acid, một chất có khả năng hạn chế được bệnh ung thư (Kjersti và ctv., 2007).
Ở Việt Nam, cây dâu tây được trồng chủ yếu ở Đà Lạt và đã trở thành loại cây
ăn quả đặc sản của vùng này. Việc sản xuất cây dâu tây mang lại hiệu quả kinh tế
cao và ổn định. Hiệu quả kinh tế trong sản xuất cây dâu tây ở Đà Lạt có nơi đạt trên
50 triệu đồng/1.000 m2/năm (Nguyễn Thị Phúc, 2006).
Sản phẩm từ quả dâu tây rất đa dạng. Ngoài việc được sử dụng ở dạng tươi,
quả dâu tây còn được dùng làm rượu vang, mứt và các loại kem. Do đó, nhu cầu
tiêu thụ của quả dâu tây ngày càng được gia tăng.
Việc trồng cây dâu tây còn gắn liền với công nghệ chế biến, góp phần giải
quyết công ăn việc làm cho lao động tại địa phương. Vì vậy, cây dâu tây được xếp
vào danh sách những loại cây trồng được ưu tiên đầu tư theo hướng công nghệ cao
của tỉnh Lâm Đồng (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002).
Cây dâu tây thường được nhân giống truyền thống bằng cách tách thân bò và
tách cây con từ thân chính. Phương pháp nhân giống này cho hệ số nhân giống
không cao, cây con dễ bị nhiễm một số bệnh từ cây mẹ, đặc biệt là bệnh virus.
Chính vì vậy, việc sản xuất cây con giống sạch virus là khâu cơ bản nhất của ngành
trồng cây dâu tây (Trần Văn Minh, 1997).

1



2


Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu về nhân giống, tạo
giống sạch bệnh trên cây dâu tây cũng như những nghiên cứu về bệnh virus và nhân
giống cây trồng sạch bệnh virus.
1.2.2 Mục tiêu của đề tài
Tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy giúp nâng cao khả năng tạo chồi, nhân
chồi và chất lượng cây dâu tây nuôi cấy mô.
Tạo cây dâu tây giống sạch virus SCV, có khả năng sinh trưởng tốt sau khi
được trồng ra vườn ươm.
1.2.3 Yêu cầu của đề tài
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc phát sinh chồi từ mô lá cây
dâu tây in vitro.
Xác định kỹ thuật nhân chồi thích hợp cho cây dâu tây in vitro.
Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng của cây dâu tây
trong điều kiện in vitro và sau khi được trồng ra vườn ươm.
Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm.
1.3 Giới hạn của đề tài
1.3.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2008 - 10/2009.
1.3.2 Địa điểm nghiên cứu
Nhân giống cây dâu tây thông qua nuôi cấy mô lá đối với ba giống cây dâu tây
Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu Pháp được hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo
Giống cây trồng, vườn ươm của Viện Sinh học Tây Nguyên.
Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây cấy mô sau khi được trồng ra vườn ươm
bằng kỹ thuật RT-PCR, được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật
của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường.

3