TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
---------------------------

TRẦN PHƯƠNG THẢO

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY HOA ĐỒNG TIỀN BẰNG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Hà Nội, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
---------------------------

TRẦN PHƯƠNG THẢO

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
CÂY HOA ĐỒNG TIỀN BẰNG KĨ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN VĂN ĐÍNH

Sinh viên

TRẦN PHƯƠNG THẢO


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................. 2
3. Ý Nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................. 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesoni Hook.f.1889) ....... 3
1.1.1. Phân loại............................................................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học ...................................................................... 4
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố .......................................................................... 5
1.1.4. Giá trị sử dụng .................................................................................. 6
1.1.5. Kĩ thuật trồng và thu hoạch............................................................... 6
1.1.6. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền...................................................... 7
1.2. Kết quả nhân giống hoa đồng tiền bằng kĩ thuật nuôi cấy mô ............... 9
1.2.1. Trên thế giới ...................................................................................... 9
1.2.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 11
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 13
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 13
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm.............................................................. 13
2.3.1. dụng cụ ............................................................................................ 13
2.3.2. Thiết bị ............................................................................................ 13
2.4. Môi trường nuôi cấy.............................................................................. 13
2.5. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 13

IBA:

Indol butyric acid

MS:

Murashige và Skoog

NXB:

Nhà xuất bản

2,4 – D:

2,4 - Dichlorophenoxy acetic aicd

Kinetin:

6-furfurylaminopurine

DTZ:

Thidiazuron

CT:

Công thức


DANH MỤC CÁC BẢNG

gọi là hoa mặt trời hay hoa Phu Lăng) có nguồn gốc từ Nam Phi. Đến nay,
hoa đồng tiền được trồng ở nhiều nước trên thế giới điển hình là: Hà Lan, Mỹ,
Đức, Nhật, Trung Quốc…[1].
Với vẻ đẹp của nó, hoa đồng tiền đã được xếp vào là một trong mười
loại hoa đẹp nhất trên thế giới (sau hoa Hồng, hoa Cúc, hoa Lan, hoa Cẩm
Chướng, hoa Lay Ơn) [19]. Chúng thường được dùng làm bó hoa, lẵng hoa,
cắm nghệ thuật hoặc được trồng vào chậu cây cảnh để trang trí. Trong sản
xuất, cây hoa đồng tiền là loài hoa có giá trị kinh tế cao.
Hoa đồng tiền có thể nhân giống bằng phương pháp hữu tính và
phương pháp nhân giống vô tính. Nhưng hầu hết các giống trồng thương
mại được sản xuất bằng nhân giống vô tính để duy trì tính đồng nhất và
không lẫn tạp về mặt di truyền [20].
Trong các phương pháp nhân giống vô tính, nhân nhanh thông qua
phân tách cụm chồi là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong
nhiều thập kỉ qua. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp cắt chồi
đối với hoa đồng tiền [21].
Nhưng tất cả các phương pháp này đều tốn rất nhiều thời gian khi
áp dụng vào sản xuất đại trà, cây dễ nhiễm bệnh, độ đồng đều thấp và mau
thoái hoá giống.
Vì vậy, chúng ta phải tìm ra một phương pháp có thể áp dụng được
trên quy mô lớn, nhanh hơn, dễ thực hiện hơn và đạt hiệu quả kinh tế cao.
Trong đó, kĩ thuật nuôi cấy mô đang được sử dụng thay thế cho các
phương pháp nhân giống truyền thống. Phương pháp này cho phép tăng
số lượng cây giống lên gấp hàng triệu lần mỗi năm [14] [6].

1


Với các lý do trên chúng tôi chọn đề tài "Hoàn thiện quy trình nhân
giống cây hoa đồng tiền bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật" nhằm


Plantae

Ngành:

Ngọc Lan

Lớp:

Magnoliopsida

Họ:

Asteraceae

Chi:

Gerbera

Tên Việt Nam: hoa Đồng tiền, hoa mặt trời Phu Lăng
Chi đồng tiền (Gerbera) có khoảng 40 loài [10]. Các giống trồng hiện
nay là con lai giữa G. viridifilia Schult Bip và G. jamesonii với các giống lai
tự nhiên ở Nam Phi.
Trong đó một số

giống quan trọng của hoa đồng tiền là Cream

Clementine, Maron Clementine, Delphi, Vesta, Uranus, Terraqueen, Dusty,
Valentine, Diablo, Mariso and Pascal [13].
Năm 1889, hoa đồng tiền được Hook miêu tả lần đầu tiên trong tạp chí

trị cao, được ưa chuộng hơn cả và cũng là đối tượng của nuôi cấy mô tế
bào thực vật.
1.1.2. Đặc điểm thực vật học
Cây hoa đồng tiền thuộc loại cây thân thảo họ Cúc.
- Thân, lá: Thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa
phát triển từ thân. Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 - 45o, hình dáng lá

4


thay đổi theo giống và sự sinh trưởng của cây, từ hình trứng thuôn đến hình
thuôn dài. Lá dài từ 15 - 25 cm, rộng 5 - 8 cm, có hình lông chim, xẻ thuỳ
nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung.
- Rễ: rễ đồng tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khoẻ, rễ hình ống, ăn
ngang và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích
lá toả ra.
- Hoa: đồng tiền do hai loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là
loại hoa tự đơn hình đầu. Hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc ở phía ngoài xếp
thành vòng hoặc vài vòng nhỏ, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được
gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa, rất được chú trọng. Trong quá trình hoa nở, hoa
hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự ngoài vào theo từng vòng một.
- Quả: quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt
nhỏ, một gam hạt có khoảng 280 - 300 hạt [4].
1.1.3. Nguồn gốc, phân bố
Hoa đồng tiền có nguồn gốc ở nam Phi, năm 1697 Relomen phát hiện
thấy ở vùng phía Nam Châu Phi (Delansia) và ông đã đưa về vườn thực vật
nước Anh.
Iwin Lych là người đầu tiên tiến hành lai tạo các giống đồng tiền với
nhau. Sau đó người Pháp và người Hà Lan cũng tiến hành lai tạo và dần dần
hai nước này cũng trở thành trung tâm tạo giống cho đồng tiền thế giới.

Trồng đồng tiền chậu thích hợp nhất là ở vụ tháng 3 để thu hoạch vào
dịp Tết Nguyên Đán, nên trồng đồng tiền trong nhà có mái che.
Giá thể trồng đồng tiền chậu thích hợp nhất là hỗn hợp đất, xơ dừa và
phân chuồng đã hoai mục, trước trồng giá thể phải được xử lý nấm bệnh.
Cho giá thể vào chậu cách miệng chậu 3 - 5 cm. Đặt cây ở chính giữa
và phải trồng nổi, cổ rễ cao bằng bề mặt giá thể. Sau trồng tưới đẫm nước.

6


Trong quá trình phát triển của cây phải thường xuyên theo dõi tình hình
sâu bệnh để có hướng khắc phục sớm nhất.
Thu hoạch thích hợp nhất khi cuống hoa đứng thẳng, các cánh hoa
ngoài mở phẳng ra, và thường thu hoạch khi cây khoảng 1 – 2 năm tuổi [28].
1.1.6. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền
1.1.6.1. Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới
Hiện nay, công tác nghiên cứu và sản xuất hoa ở nước ngoài rất phát
triển. Trình độ tạo giống sản xuất của các nước Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ,
Đức… rất cao như công ty Florist của Hà Lan là công ty dẫn đầu thế giới về
tạo giống, nghiên cứu, sản xuất, buôn bán hoa đồng tiền. Họ có lực lượng rất
mạnh về nghiên cứu khoa học về thiết bị sản xuất đã tạo ra rất nhiều giống,
sản lượng ngày càng nhiều, việc xử lý sau thu hoạch, bảo quản, đóng gói đều
ở trình độ rất cao.
Ở Trung Quốc, ngay từ những năm 20 của thế kỷ XX đã có sản xuất
hoa đồng tiền cắt cành. Nhưng do giống thoái hóa nghiêm trọng nên không
phát triển được. Cho đến năm 1987, vận dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ
thuật nhân giống nhanh khắc phục được tình trạng thoái hóa giống, thì hoa
đồng tiền mới khôi phục và phát triển. Hiện nay, Thượng Hải là nơi có diện
tích trồng lớn nhất 35 ha, trong đó trung tâm nhân giống hoa Hà Viên Nghê ở
nông trường Đông Hải đứng đầu trong sản xuất và nhân giống hoa đồng tiền.

tích trồng trọt được mở rộng nhưng phân tán, lực lượng kĩ thuật không tập
trung lại thêm thiết bị sản xuất thấp, chất lượng kém, ảnh hưởng nghiêm trọng
đến hiệu quả kinh tế.
Trang thiết bị trồng trọt lạc hậu, hàm lượng kỹ thật cao ít. Tỷ lệ thiết bị
tiên tiến trong trồng trọt rất nhỏ, cách trồng cổ truyền vẫn chiếm ưu thế gây
nên sản lượng thấp, chất lượng kém. Mùa vụ sản xuất không phù hợp với nhu
cầu, khả năng cung ứng hoa quanh năm không mạnh làm cho giá cả không ổn
định, hiệu quả kinh tế thấp.

8


Công tác chọn tạo giống mới chậm so với sản xuất. Hiện nay, giống
trong sản xuất rất ít. Đa số là nhập giống từ nước ngoài, không tự sản xuất
được. Các giống trồng trong sản xuất đã lạc hậu. Biểu hiện ở năng suất thấp,
không tươi lâu, cây dễ nhiễm bệnh.
Giá thành bao gói cao. Thời gian bảo quản hoa đồng tiền có thể dài,
nhưng cành giòn, dễ gãy. Việc bao gói hiện nay vẫn đơn giản nên tỷ lệ tổn
thất sau thu hoạch tương đối cao.
1.2. Kết quả nhân giống hoa đồng tiền bằng kĩ thuật nuôi cấy mô
1.2.1. Trên thế giới
Theo Akter và cs (2012), giai đoạn tạo callus và tái sinh chồi sử dụng vật
liệu là chồi hoa và nụ hoa cấy trong môi trường: MS + 5,0 mg/l BAP và 1,0
mg/l NAA. Đến giai đoạn nhân nhanh, số lượng chồi nhiều nhất thu được ở mô
sẹo có nguồn gốc nụ hoa với môi trường: MS + 2,0 mg/l BAP. Giống hoa đồng
tiền màu đỏ cho phản ứng tốt hơn so với giống hoa đồng tiền vàng và trắng.
Môi trường tốt nhất để tạo rễ cho chồi hoa đồng tiền là: ½ MS + 0,2 mg/l
IBA [15].
Theo Naz và cs (2012), môi trường: MS + 10 mg/l BAP cảm ứng chồi
tốt nhất thu được sau 8 ngày đối với mô phân sinh đỉnh. Chồi sau khi đạt được

và rễ cây. Sau 4 tuần, mô sẹo trắng hình thành với tỷ lệ 70% trong môi trường
MS bổ sung 2,4 – D. Cụ thể là mô sẹo có nguồn gốc từ lá và cuống lá được
hình thành trong môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l – 2,0 mg/l 2,4 – D kết hợp
với 3,0% sucrose và 0,8% agar. Sau đó, mô sẹo được chuyển vào môi trường
MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4 – D và 0,1 mg/l NAA trong 1 tháng. Sự giảm bớt
nồng độ 2,4 – D giúp cho sự cảm ứng và tăng trưởng của các tế bào soma [17].
Đối với giống hoa đồng tiền Gerbera jamesoni cv. Cabana, theo Bhatia
và cs (2012), sử dụng cụm hoa ở giai đoạn chưa trưởng thành có kết quả tốt
hơn giai đoạn trưởng thành và được cấy trong môi trường MS + 10 mg/l BAP
và 1 mg/l IAA. Sau đó, sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm

10


cytokinin để kích thích sự phát triển của chồi. Trong đó, môi trường bổ sung
BAP cho chất lượng chồi tốt hơn so với môi trường bổ sung Kinetin. Khi kết
hợp 1 mg/l BAP và 0,1 mg/l IAA ta thu được số lượng và chất lượng chồi là tốt
nhất. Môi trường cảm ứng ra rễ là: ½ MS + 1mg/l IBA [7].
Năm 2013, Bhavya Bhargava và cs nghiên cứu tiến hành nhân giống
trên Gerbera jamesonii Bolus cv. Harley. Môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là
MS + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA. Môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh
là MS + 4 mg/l BAP và 2 mg/l Kinetin. Giai đoạn ra rễ cần ½ MS + 2 mg/l
IBA [8].
Theo Kumar và cs (2007), Hoa đồng tiền được tái sinh mô sẹo từ các tế
bào lá. Môi trường cảm ứng callus tốt nhất là môi trường: MS + 1,5 mg/l 2,4
– D và MS + 2,0 mg/l 2,4 - D. Tỷ lệ bật chồi ở mô sẹo cao nhất trên môi
trường MS + 1,0 mg/l BAP. Ở môi trường MS + 1,5 mg/l 2,4 – D, mô sẹo rất
dễ vỡ vụn và có khả năng tái sinh thấp. Sau đó, các mô sẹo được chọn lọc và
đưa vào nghiên cứu dịch treo tế bào trong môi trường MS lỏng kết hợp với
1,5 mg/l 2,4 – D. Mô sẹo bật chồi trên môi trường MS + 1 mg/l BAP. Cây con

hoàn chỉnh có môi trường ra rễ hoa đồng tiền là: MS + 0,1 ppm NAA +
2,5% đường Saccaroza + 6,5 g Agar/l. Giá thể thích hợp nhất cho việc ra cây
là 1 mùn + 1 trấu hun [3].
Theo Ngô Đăng Vịnh và cs (2014), vật liệu vào mẫu là đế hoa đồng tiền
non của các giống hoa đồng tiền nhập nội từ nước ngoài. Sử dụng dung dịch
HgCl2 nồng độ 0,1 % với thời gian 10 phút là thích hợp nhất cho khử trùng đế
hoa đồng tiền. Môi trường tạo callus và tái sinh chồi là MS + 0,2 mg TDZ/l
+ 0,1 mg NAA/l + 50 g đường/l + 6 g agar/l. Môi trường nhân nhanh tốt nhất
là môi trường bán lỏng MS + 1,5 mg BAP/l + 10% nước dừa + 1mg/l B1
+ 50 g đường/l + 3 g Agar/l. Môi trường ra rễ là môi trường MS + 0,5 mg
NAA/l + 50 g đường/l + 6 g Agar/l. Giá thể thích hợp nhất cho cây con
trong giai đoạn vườn ươm là hỗn hợp: 1 đất + 1 trấu hun + ¼ vi sinh [5].

12


Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu cây hoa đồng tiền sạch bệnh do phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật,
khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 từ ngày 10/11/2015 - 04/03/2016.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, panh gắp, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, pipet,
kéo, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15 ml,...), giấy báo, giấy thấm,…
2.3.2. Thiết bị
Cân kĩ thuật, tủ lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh

trên môi trường nghiên cứu MS, saccarozo 3%, agar 0,7% bổ sung Kinetin có
nồng độ khác nhau. Các công thức nghiên cứu được thực hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình nhân
nhanh chồi in vitro của cây hoa đồng tiền
Công thức

Kinetin bổ sung (mg/l)

CT1

0,0

CT2

0,1

CT3

0,3

CT4

0,5

CT5

0,7

CT6



CT4

0,5

CT5

0,7

CT6

1,0

CT7

1,5

2.6.2.2. Ra rễ - tạo cây hoa đồng tiền in vitro hoàn chỉnh
Chồi in vitro cây hoa đồng tiền 30 ngày tuổi được tách riêng lẻ và cấy
trên môi trường nghiên cứu MS, saccarozo 3%, agar 0,7% bổ sung α - NAA
có nồng độ khác nhau. Các công thức nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α - NAA đến
quá trình ra rễ của cây hoa đồng tiền in vitro
Công thức

Nồng độ α - NAA (mg/l)

CT1

0,0

CT2

Đất + Xơ dừa

CT3

Đất + Xơ dừa + Mùn

2.6.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được phân tích theo các tham số thống kê gồm các giá trị
trung bình, độ lệch chuẩn… trên chương trình Excel 2007 sự sai khác giữa các
công thức được kiểm định bằng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với α = 0,05 [2].

16