TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
----------------

HÀ THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG,
SINH LÝ – HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN
(As)
CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI CẤY IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HÀ NỘI - 2017

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
----------------

HÀ THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH TRƯỞNG,
SINH LÝ – HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASEN
(As)
CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN NUÔI CẤY IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
As
DNA
KLN

Asen
Deoxyribonucleic acid
Kim loại nặng

PCR

Phản ứng khuếch đại gen


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1.

Lý do chọn đề tài
Môi trường bị ô nhiễm do các hoạt động khai khoáng và tuyển quặng đã được
nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Trong đó kim loại nặng KLN là chất gây
ô nhiễm hàng đầu vì chúng không dễ dàng bị vi sinh vật (VSV) phân giải. Một số
KLN là các nguyên tố vi lượng không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
sinh vật như Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, As, Cd,… tuy nhiên với nồng độ cao, đây lại là
những chất rất độc đối với cơ thể sinh vật và con người. Đặc biệt hàm lượng As trong

dụng thuốc lá làm cây mô hình nghiên cứu sự chuyển gen liên quan đến khả năng tích
luỹ kim loại nặng, cụ thể là gen arsC liên quan đến việc hấp thu và tích lũy As. Đề tài
đã thực hiện xong các nội dung: tách thành công gen arsC từ cây dương xỉ
(Microsorum pteropus) có khả năng tích lũy As cao đang sinh trưởng ở vùng đất mỏ bị
ô nhiễm và đã chuyển gen arsC vào cây thuốc lá K326.
Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một
số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý - hóa sinh và khả năng tích lũy asen (As) của các
dòng thuốc lá chuyển gen arsC ở giai đoạn in vitro” nhằm đánh giá một số chỉ tiêu
sinh trưởng sinh lý-hóa sinh của cây thuốc lá chuyển gen arsC nuôi cấy in vitro, phục
vụ cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo trên con đường sử dụng thực vật chuyển gen
xử lý đất ô nhiễm As.
1.2.
-

Mục đích nghiên cứu
Tìm ra các dòng thuốc lá chuyển gen có chứa gen arsC.
Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng, sinh lý-hóa sinh của các dòng thuốc lá chuyển
gen nuôi cấy in vitro.

1.3.

Nội dung nghiên cứu

-

Kiểm tra sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá chuyển gen.
Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây thuốc lá chuyển gen trong môi trường

-


Hình 1.1.Mẫu As trong ống nghiệm
Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Asen

As đã được biết đến và sử dụng tại Ba Tư từ thời cổ đại. Do triệu chứng ngộ độc
As không rõ ràng nên nó thường được sử dụng làm chất giết người cho đến khi phát
hiện ra thử nghiệm Marsh, một thử nghiệm rất nhạy để phát hiện ra sự tồn tại của nó.
Trong thời kì đồ đồng, As được sử dụng trong các hợp kim, làm cho đồng trở nên cứng
hơn. Albertus Magnus (1193-1280) được coi là người đầu tiên cô lập được As nguyên
tố vào năm 1250. Năm 1649, Johann Schoder công bố 2 cách điều chế As. Các dạng
As vô cơ và hợp chất của nó khi đi vào chuỗi thức ăn, được trao đổi tích cực thành
dạng ít độc hơn thông qua quá trình metyl hóa [4].
As là nguyên tố đặc biệt cần thiết khi ở hàm lượng rất thấp và là chất độc cực
mạnh khi ở hàm lượng đủ lớn. Hàm lượng As trong đất, nước, …cao có thể do các quá
trình tự nhiên và do hoạt động của con người đặc biệt là quá trình khai thác khoáng
sản. As có nhiều trong mỏ khoáng suphit, vì vậy nó có thể phát tán vào không khí hay

10


nguồn nước từ các lò luyện kim. Than đá cũng chứa một lượng lớn đáng kể As, quá
trình đốt than đã phát tán tới hơn 20% lượng chất này vào khí quyển.
Khi ở trạng thái rắn As là chất bột màu trắng. As tan trong nước tạo thành dung
dịch không màu, không mùi, không vị ngay cả khi hàm lượng As trong dung dịch cao
nên phát hiện nó bằng trực giác rất khó.
As (và một số hợp chất của As) thăng hoa khi bị nung nóng ở áp suất tiêu chuẩn,
chuyển hóa trực tiếp thành dạng khí mà không chuyển qua trạng thái lỏng. Đó là lý do
vì sao nhiệt độ sôi của As lại thấp hơn nhiệt độ nóng chảy. Nhiệt độ sôi của As là
887oC, trong khi nhiệt độ nóng chảy là 817oC.
1.4.1.2.


các bộ phận giàu biểu mô như niêm mạc gây nhiễm độc cấp tính.
Cơ chế gây độc của As là tấn công vào các nhóm sulfuahydryl của enzyme làm
cản trở hoạt động của các enzyme, gây đông tụ các protein do chúng tấn công vào liên
kết có nhóm sunfua và phá hủy quá trình photphat hóa tạo ra ATP [7].
Hàm lượng As trong cơ thể người khoảng 0,008-0,2 ppm, tổng lượng As có
trong người bình thường khoảng 1,4 mg. Trong nhóm dân cư khu vực nông thôn trung
bình là 0,4 - 1,7 ppm, khu vực thành phố công nghiệp 0,4 - 2,1 ppm còn khu vực ô
nhiễm nặng là 0,6 - 4,9 ppm [11].
Ở động vật có vú, tế bào có cơ chế giảm độc As nhờ sự metyl hóa arsenate. Quá
trình này có sự tham gia tích cực của các chất nhường gốc metyl.
As (V)

2GSH
GSSG

As (III)
Methyltransferase

S-adenosylhomocystein
CH3As (V)
2GSH
GSSG
CH3As(III)

SAM
Methyltransferase
S-adenosylhomocystein
Hình 1.2. Sự methyl hóa asenate bởi tế bào
động vật có vú
(CH3)2As(V)

zizanioides L.) và dương xỉ (Pteris vittata L.), cải xanh (Brassica juncea), nghé nước
(Polygonum hydropiper),…Một số nước trên thế giới cũng sử dụng cỏ Vetiver nhằm
mục đích chống xói mòn, cải tạo thảm thực vật và đặc biệt là khả năng xử lý ô nhiễm
KLN trong đất ở các vùng mỏ và hạ du [5].
1.4.2.2.

Ở Việt Nam
Theo tác giả Đỗ Văn Ái và cộng sự, ở Việt Nam có 3 vùng ô nhiễm As là: vùng
núi với các biến đổi đá nhiệt dịch, quặng vàng, đá kim, sunfua và vỏ phong hóa cũng
như đất phát triển trên chúng; vùng đồng bằng với nguồn ô nhiễm As tự nhiên (oxi hóa
khoáng vật sunfua và khoáng vật chứa As trong trầm tích, khử các hydroxit sắt chứa
As) và hoạt động của con người; đới duyên hải (trầm tích ven bờ một số vùng ở Quảng
Ngãi, Phú Yên) ô nhiễm do sử dụng thuốc trừ sâu, diệt cỏ và vũ khí hóa học của con
người [1]. Kết quả phân tích đất trồng ở khu vực mỏ thiếc Sơn Dương, Tuyên quang

13


có hàm lượng As là 642 mg/kg trong khi tiêu chuẩn đặt ra là 12 mg/kg (QCVN
03:2008/BTNMT) [2].
Bảng 1.1. Quy chuẩn quốc gia về giới hạn cho phép của As trong đất
trong một số loại đất
Đơn vị tính: mg/kg đất khô
Thông số

Đất nông

Đất lâm

Đất dân

Quốc (UNICEF) đã tiến hành khảo sát nồng độ As trong nước của hơn 71.000 giếng
khoan thuộc 17 tỉnh đồng bằng miền Bắc, Trung, Nam. Kết quả phân tích cho thấy
nguồn nước giếng khoan ở các tỉnh lưu vực sông Hồng như: Hà Nam, Nam Định, Hà
Tây, Hưng Yên, và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp đều
bị nhiễm As rất cao. Tỉ lệ các giếng có nồng độ As từ 0,1 mg/l đến > 0,5 mg/l (cao hơn
mức tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam và tổ chức Y tế thế giới 10-50 lần) của các xã
dao động từ 59.6-80%. Ở Hà Nội 40% giếng khoan có hàm lượng As lớn hơn mức an
toàn nhiều lần [9].
Bảng 1.2. Giá trị cho phép của nồng độ các chất ô nhiễm trong nguồn nước
Đơn vị tính: mg/l
Tiêu chuẩn chất lượng nước
Thông số
Asen (As)

mặt
Giới hạn A
Giới hạn B
0,05
0,1

Tiêu chuẩn nước
ngầm
0,05

Đơn vị
mg/l

Nguồn: TCVN 5942-1995; TCVN 5944-1995

1.4.3. Các phương pháp xử lý asen trong đất và nước

7000 mg/kg sinh khối khô [1] [3] [5] [6] [8]. Hiện nay người ta cũng đã tìm thấy rất
nhiều loài VSV có khả năng tích lũy một lượng lớn KLN trong tế bào của chúng ví dụ
như: Vi khuẩn Bacillus CH34 được sử dụng để xử lý chất ô nhiễm Cd, Zn, Pb. Do đó,
xử lý đất và nước chứa KLN bằng biện pháp sinh học đang trở thành một hướng đi
đầy triển vọng. Một số biện pháp xử lý KLN nhờ thực vật đang được áp dụng như:
Xử lý bằng vùng rễ: như cỏ có rễ sợi (cỏ đuôi trâu), cây sản xuất ra các hợp chất
phenol (dâu tằm, táo), thực vật thủy sinh. Các loài này tiết ra các chất để kích thích các
vi sinh vật vùng rễ như nấm men, nấm, vi khuẩn phát triển và phân giải các chất ô
nhiễm qua quá trình trao đổi chất của chúng.
15


Cố định các chất ô nhiễm: các loài có rễ sợi, ưa nước ngầm hấp thụ hay hấp phụ
các chất ô nhiễm vào rễ làm giảm khả năng di động của chúng trong môi trường.
Chiết suất bằng thực vật: là quá trình sử dụng thực vật để hấp thụ các KLN ở đất
vào trong rễ và vận chuyển chúng lên các bộ phận khác của cây. Tại đó, KLN được
tích lũy và có thể được thu hồi lại sau khi xử lý sinh khối.
Công nghệ lọc bằng rễ : Quá trình này dựa trên khả năng hút và giữ các chất ô
nhiễm bởi hệ rễ của các thực vật thủy sinh để xử lý nước thải có chứa KLN, chất
phóng xạ, hợp chất hữu cơ kị nước và chất nổ.
Không giống như các phương pháp truyền thống, các phương pháp sinh học không
tạo ra các chất thải hóa học giàu As khó xử lý. Thay vào đó, chất nhựa được tách ra từ cây
dương xỉ có khoảng ¾ là asen, có thể chiết suất và sử dụng trong công nghiệp.

1.4.4. Tình hình nghiên cứu xử lý ô nhiễm asen trong và ngoài nước
1.4.4.1.

Trên thế giới
Trong những năm gần đây, Trung quốc đã tiến hành một dự án thử nghiệm trồng
cây để thu gom As độc hại trong đất. Theo Chen Toongbin thuộc viện Khoa học địa lý

đã phát triển thành một hướng cải tạo môi trường hiệu quả, an toàn và tiết kiệm. Tuy
nhiên, những công trình đã nghiên cứu mới sử dụng các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn
và mới bước đầu sử dụng gen từ thực vật để đưa vào một số cây mô hình như
Arabidopsis, cải dầu…..
1.4.4.2.

Ở Việt Nam
Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu về ô nhiễm KLN cũng đã được chú ý đến trong
những năm gần đây. Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam,
và một số cơ sở nghiên cứu của các trường đại học như Khoa Môi trường, Đại học
Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Tài nguyên môi trường, Đại học
Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã bước đầu điều tra và nghiên cứu xử lý ô nhiễm KLN.
Các nghiên cứu tập trung vào thống kê mức độ ô nhiễm KLN và khả năng hấp thu
KLN ở một số cây như dương xỉ, bèo tây, ngổ, cỏ Vetiver …
Nghiên cứu của Bùi Cách Tuyến và cộng sự đã chỉ ra: loài cỏ Vetiver hay còn gọi là
cỏ Hương Bài có khả năng hút các kim loại như Cu, Zn, Pb, Cd, As. Sinh trưởng của loại cỏ
này tăng khi trên đất trồng có nồng độ 1055,15 ppm Pb và hàm lượng tích lũy các kim loại
này tỉ lệ thuận với nồng độ các kim loại trong đất và thời gian trồng cỏ [6].
Nghiên cứu của Bùi Thị Kim Anh và cộng sự (2011) cho thấy, loài dương xỉ
Pteris vittata có khả năng chống chịu khá tốt trong đất có hàm lượng As linh động
tương ứng lên tới 1500mg/kg và trong đất thải của quặng có chứa 15.146 ppm As tổng
17


số. Trong khoảng nồng độ mà cây chống chịu được, Pteris vittata tích lũy lượng As từ
307 – 6042 ppm trong thân, 131-3756 ở rễ. Ngoài ra, loài này còn có thể sử dụng cho
xử lý Pb và Zn nếu cùng tồn tại trong đất với hàm lượng thấp [1].
Đề tài Nafosted (cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học) đã thực hiện tách
dòng thành công gen arsC từ cây dương xỉ (Microsorum pteropus). So sánh trình tự
gen arsC nghiên cứu với trình tự gen gốc mang mã số X80057.1 trên Genebank cho

Tên mồi

Trình tự nucleotide

arsCTACCATGGACTGATATGAGCAAC ATTACC
Ncol/F
arsCTACACGTGTTA TTT CAG GCG CTT ACC
Eco72l/R

%GC

Tm
(oC)

Kích thước
(nucleotide)

31,8

58,5

21

44,4

57,8

18

2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, thu lấy bột rồi cho vào ống eppendorf. Thêm
750 μl đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Ủ trong bể ổn nhiệt 65 oC trong 30
phút, lắc nhẹ nhàng 5 phút/lần. Sau đó chuyển hỗn hợp ra để ở nhiệt độ phòng trong 5
phút. Thêm 750 μl dung dịch chloroform : Isoamyl alcohol 24 : 1 lắc nhẹ trong 10 phút.
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa DNA bằngisopropanol tỉ lệ 1 : 1, xoay nhẹ
nhàng vài phút rồi giữ ở - 20 oC trong 1giờ. Ly tâm 10.000 vòng/ phút, trong 10 phút,
loại bỏ dịch và thu tủa. Hòa tan tủa trong 0.5 ml TE pH= 8 để ở tủ 4oC qua đêm.
Thêm 15 µl RNase, ủ ở 37oC trong 90 - 120 phút để loại bỏ hoàn toàn Rnase.
Thêm dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol 25 : 24 : 1, lắc nhẹ trong 15
phút, ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch sang ống effendorf mới sau đó thêm
Chloroform: Isoamyl alcohol 24 : 1 tỷ lệ 1 : 1, lắc nhẹ trong 15 phút. Ly tâm 10.000
vòng/phút, 10 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới và tủa trong isopropanol tỉ lệ
1 : 1, để hỗn hợp ở -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 10.000 vòng/phút , 7 phút. Loại bỏ dịch
nổi phía trên, thu tủa và rửa bằng cồn 70% lạnh. Thổi khô trong 20 phút ở trong box
cấy. Hòa tan tủa bằng TE và giữ trong tủ -20oC. Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%.
2.2.2. Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR sử dụng nhân gen arsC được thực hiện với hỗn hợp phản ứng
gồm 1 µl DNA tổng số (25 ng/µl); 13,4 µl H2O; 2,0 µl Buffer 10xPCR; 2,5 µl dNTP (1
mM); 0,5 µl mồi F (50 ng/μl); 0,5 µl mồi R (50 ng/μl); 0,1 µl enzyme Taq polymerase
(5 U/μl). Phản ứng PCR được tiến hành với chu kì nhiệt: 94oC trong 5 phút; 35 chu kỳ
của 94oC 50 giây; 50oC (tùy thuộc Tm của mồi) 50 giây; 72oC 1 phút 30 giây và bước
cuối cùng 72oC trong 5 phút sau đó điện di trên gel agarose 1%.
2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh trưởng
Các chỉ tiêu nghiên cứu được xác định tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy, tương ứng
với 6 tuần bổ sung As vào môi trường.
2.2.3.1. Tỉ lệ sống sót
Tỉ lệ sống sót được tính bằng số mẫu sống trên tổng số số mẫu cấy ban đầu.

20


C: Nồng độ diệp lục trong dịch chiết
N: Số lần pha loãng
V: Thể tích dịch chiết
1000: Hệ số chuyển ml ra l
2.3.4.4. Xác định hàm lượng đường khử trong lá bằng phương pháp DNS
Pha 1ml đường glucose chuẩn. Tiến hành pha dãy glucose chuẩn theo các mức
nồng độ lần lượt là: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 (mg/ml). Cân 1g nguyên liệu tươi, nghiền
nhỏ bằng cối sứ trong 2 ml nước cất, tráng lại chày cối và dẫn lên 5 ml. Đem ly tâm
21


5000 vòng/phút trong 5 phút.Lấy 250 μl dung dịch glucose chuẩn ở các mức nồng độ
cho lần lượt vào các ống eppendorf sau đó thêm 250 μl dung dịch thuốc thử DNS, trộn
đều. Tiến hành tương tự với dung dịch mẫu nghiên cứu.Đun cách thủy các ống
eppendorf trong 5 phút. Nạp mẫu và dung dịch đường chuẩn vào bản nhựa 96 giếng
sau đó đo ở bước sóng 540 nm.
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức: A =
Trong đó:
A: Hàm lượng đường khử trong lá (mg/g)
X: Mật độ quang của mẫu
n: Hệ số pha loãng của mẫu
V: Thể tích dịch đường gốc (ml)
m: Khối lượng mẫu cân (g)
2.3. 4.2. Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ bằng iot
Cân 0,5g mẫu tươi, nghiền nhuyễn với 5ml HCl 5%, cho vào ống đong dẫn đến
50ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20 ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích
100ml, nhỏ thêm 10 giọt tinh bột rồi tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch I 2 cho đến khi
có màu xanh lam nhạt.
Hàm lượng vitamin C được tính theo công thức:
Trong đó:

2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học Microsoft Excel, SPSS phiên
bản 16,0. Sự sai khác giữa các giá trị bằng One way – ANOVA (Turkey’s – b) ở mức ý
nghĩa α = 0,05.

23


PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá chuyển gen arsC bằng kĩ
thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu arsC- R/F
Sau 4 tuần nuôi cấy cây thuốc lá (trong điều kiện chiếu sáng với cường độ 2000
lux ở 25oC) những mảnh lá bánh tẻ của 24 dòng thuốc lá chuyển gen khỏe mạnh được
lựa chọn để tách chiết DNA tổng số phục vụ cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
arsC-R/F nhân gen arsC.
Kết quả điện di DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen được thể hiện trên
hình 3.1.

Hình 3.1.Kết quả điện di DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen.
1- 24: dòng thuốc lá chuyển gen từ 1 – 24. M: marker Fermentas 1kb
Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.1 cho thấy các băng đều và rõ nét, như vậy
ADN tổng số của các mẫu thuốc lá đã được tách chiết thành công. Sự có mặt của gen
đích được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân gen arsC và sử
dụng DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen làm khuôn mẫu. Kết quả điện di
sản phẩm PCR thể hiện trên hình 3.2.

24