VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM
VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T
****************

C S SINH H C

LU

TÀI
D

NH T N SU

T BI

LOOP TRONG H GEN TY TH

Chuyên ngành

: Sinh h c th c nghi m

Mã s

: 60 42 01 14

M VÙNG
I VI T NAM

ng d n khoa h c : PGS.TS. LÊ QUANG HU N
i th c hi n
L p

n b nh ty th , các b nh

c xem là m t trong nh ng m c tiêu nghiên c

b n c a di truy n h c và y h c.
V i nhi

u m i v di truy n t các th k

c mà tiêu bi u là vi c công b trình t h

i hay còn g

chi

tham

c Anderson và c ng s công b
tham chi u s

rCRS (Andrew và c ng s .

u ki n thu n l i cho các nhà khoa h c nghiên c u sinh h
là nh ng nghiên c u v
các cá th

i gi

i. Sau khi có b



t bi n
c t m quan

tr ng v vi c tìm hi u các d li u di truy n v dân t c Vi t Nam chính vì th trong
khuôn kh lu

n hành nghiên c u

m vùng D
2.

i Vi t Nam

M c tiêu:
-

L

c
3.

Loop c a h gen ty th

nh t n su

c danh sách các SNP trong vùng D
i Vi t Nam.

N i


Gi i thi u chung v ty th
Ty th (Mitochondrion) là bào quan có th tìm th y trong g

bào có nhân. S

ng c a ty th trong m i t bào

trung tâm hô h p c a t

t c các t

m i loài là khác nhau. Ty th là

n sinh ra ATP m t d

ng có th s

d ng cho các ph n ng c a t bào. Không có ty th các t bào s ph i d a vào quá
ng phân k
c a mình. Ty th có h
th m

cung c p t t c adenosin triphotphat (ATP) cho ho
c l p nên có kh

ng

sinh s n b


tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper. 2000). Khoang n
5


ch a nhi u b n sao c a ADN ty th , các ribosome c a ty th , RNA v n chuy n
(tRNA) và nhi u lo i enzym c n thi t cho phiên mã và d ch mã c a các gen ty th .
Hình 1.2.

Hình 1.2. C u trúc ty th
(hallcpbio.com)

1.1.2. Ch

a ty th

Ty th là trung tâm gi i phóng và chuy
hóa

ng c a t bào (photphoryl

oxy hóa). Ph n l

uh

c

gi i phóng và chuy n thành d ng ATP s d ng trong pha phân gi i hi u khí di n ra
ty th . Vì v y ty th

a t bào (Dahout, Gonzalez


T ng h
r t nh

ng t 50

ng cho t ng h p protein.

ng trong ty th
ng d

tr

ng phân. Ch m t ph n

c

c chuy n hóa (2ATP). S

chuy n hóa

c hoàn t t khi s n ph m c
chuy n vào trong ty th và b oxy hóa t O2 thành CO2

c
c và 36 ATP.

Các protein liên quan trong quá trình oxy hóa
màng trong ty th , bao g m các thành ph n trong chu i truy



t c a t bào ch t v

t c a ty th trong quá trình bi u hi n c a

gen (phiên mã và t ng h p protein).
1.2.

m c a ADN ty th

i và ng d ng trong nghiên c u

Ty th

i v i s ti n hóa c

c u ph bi n hi
DNA

i v i di truy n

ng v t. Nh ng nghiên

i là trên ADN ty th (mitochondrial

ADN ty th ). M c dù b gen ty th
c b gen

i ch b ng 0.0005% so v i toàn b
c tìm th y trong gen ty th có liên


gen c a h gen ty th .
Trong 37 gen này có 13 gen mã hóa cho 13 chu i polypeptide c n thi t cho h
th ng photphoryl hóa
ti

oxy hóa, bao g m 7 ti

c a ph c h I (complex I), m t

c a ph c h III (complex III), 3 ti

c a ph c h VI (complex VI)

và hai ti

c a ph c h V (complex V). S gen còn l i mã hóa cho 22 tRNA, 2

rRNA (12S và 16S) ph c v quá trình d ch mã c a ty th (Anderson S. 1981). Các
chu i polypeptit khác c n thi t cho c u trúc và ch

a ty th

c mã hóa b i

c t ng h p trong ribosom c a t bào ch t.
M

gen ty th


Loop. Ph n l n các
u
c kho ng 1.1 kb

ADN ty th có m t s vùng b t bi n n m trong vùng D

Loop bao g m vùng

promoter và vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình t b t
bi
nê

un m

D

cb ot n

r t nhi

ng v

c cho r ng có vai trò quan tr

th . Ví d , CSB I có v trí ngay g n vùng kh
(Wallberg and Clayton. 1981). Thêm n a, vùng D

a ADN ty
uc



khi n cho quá trình phiên mã c a các gen ch

c mã hóa

(Anderson. 1981, Lightowlers. 2001). H th
gi

u khi

hai phía, vì th

ut

u khi n tr i dài t v trí 16024

pt ct v
t bi n nh t v i t n s

mg n

t hi n nhi u

t bi

i các vùng khác c a h gen ty th

(Horai. 1995, Sorenson, Fleischer. 1996). Hình 1.5

()

i, có 99.9% là gi ng nhau, ch 0.1% là khác bi t. S khác bi t này

có th

ng. Ví d

phát tri n b

i

ho c ki
Nh ng bi

i này có th không có h i (nh

(gây b
sau khi v

i v ki u hình), có h i

nh tan huy t b m sinh), ho c phát tri n
ng bi

c tìm th

u hòa

gen).

1.3.2. Các v trí SNP trên gen

ng h p, SNP không n m trong vùng mã hóa protein
ns n

ng lên các y u t phiên mã,
bi u hi n gen b

là m t eSNP (s bi u hi n SNP) và có th bi u hi

1.3.3.

ng b i d

cg i

c gi m trong gen.

ng d ng và t m quan tr ng
ng d

u tiên c a SNPs ph i k

c

ti n hành y h c cá nhân. Các bi n th trong trình t ADN c
phát tri n b

i có th

nh



Các nghiên c u v SNP không nh ng t

y

b nh

u ki n thu n l i trong quá trình

phát hi n các bi n th di truy n và b nh di truy n mà còn phát tri n nghiên c u nh m
tìm ra cách phòng ng a và ch a b
ph n

mang l i các

i v i thu

u tr . Ngoài ra nhi

th giúp cho vi c l p b

c s d ng làm ch

n b nh ho c m

SNP có liên h v i các b nh
mi n, b nh th n kinh có th

ng



c t ng h p trong t bào ch t r

c v n chuy

n ty th . Chính

vì v y, các r i lo n ty th (hay b nh do ty th có th phát sinh do nh
nhân ho c gen ty th (ADN ty th ). M t s r i lo n
b nh th n kinh th giác di truy
r t nhi

n

m n i tr i v th n kinh
n có trên 150 b nh di truy n khá nhau theo m u h

do ty th quy

nh. Các b nh do r i lo n ADN ty th

th

n r i lo n quá trình mã hóa protein ho

bi

i các nucleotit (Sevidei et al. 2002).

1.4.1.


trình t h gen ty th trên 19 c
cho th y 74% b

ng r

ng c a b
t bi

t bi n thu c vùng

D Loop.

12


V ib

ng tr ng (Liu và c ng s

bi n ADN ty th
bi

mT

n l n là d

C ho c G

c 60%


Loop, trong s

t bi n thêm ho c

309 (V trí D310).

Trong các nghiên c u khác (Burgart và c ng s
nh (50 bp) trong vùng D Loop

t bi n m

4/32 (12.5%)

b

n

dày.

n
(Wu và c ng s
520 bp) trong vùng D

t bi
Loop c a ADN ty th
t bi

1.4.2.



i protein, d

n li t th n kinh th giác di truy n Leber (Leber hereditary optic
t bi n trong gen cytb gây b nh không dung n p v

ng và

myoglobin ni u (Chia-Chi Hsu và c ng s . 2013)
n nay nhi u d
bao g

t bi
is
t bi

t bi n ADN ty th
t bi n thêm ho c m

t bi n này
t bi n l

n, m

n hay

ng b n sao ADN ty th .
m

Tan và c ng s

c tìm th y

b nh

i tr c tràng (Polyak và c ng s .

t bi n ADN ty th trong các vùng mã hóa ND1, ND4, ND5,

M

n

ADN ty th b m t m

nl

nh

ung

i tr c tràng.
i s b n sao ADN ty th
Bi

i v s b n sao ADN ty th

c phát hi n

nhi u lo i b


l i có th

ng b n sao ADN ty th trong b

các gen mã hóa cho các protein c a chu i photphoryl hóa
b

ng l i s m t ch

th .

14

t

oxy hóa
a ty


2.1.

V t li u

2.1.1.

ym u

M u sinh ph
nh


(C) S d ng c t móng tay m i ho
c 5 phút. M

(E)

c kh trùng hoàn toàn b

c l y ít nh t là 1 bên bàn tay, n u có th s l y

c 2

c nhi u m
(D) M

ng trong d ng c ch a m
a ho

(E)

d dàng g
nm

ng d n.

2.1.2. Hóa ch t
Agarose (Sigma)
B kit tinh s ch DNA t ng s (Fermentas)
B kit tinh s ch s n ph m PCR (Fermentas)
B kit dùng cho ph n ng PCR (Roche)
Các m i cho ph n

Ly tâm

c
Avanti TM 30 centifuge

Ly tâm l nh

Beckman

So màu

Hewlett Packard, M

Cân

S20

Metter Toledo

Cân 10-4

Ohaus

n di

n di Agarose

Pipetman
Kh trùng
Gi i trình t

n/gia nhi t

B

n nhi t

Techne, OSI

Lò vi sóng
T l nh sâu

Samsung
750C, T l nh

-200C

T l nh

T l
Ch p nh

ng

Sanyo, Nh t B n
Sanyo, Nh t B n

Máy soi ch p nh gel

Phamarcia


sánh trình t

oedit.html

So sánh trình t v i gen chu n

/>
công b trên ngân hàng gen

SOFTGEN Bao g m các ph n m m b tr tìm
ETICS

t bi

m

2.4.

u

2.4.1.

t ADN t móng tay

D

t

(Sambrook và c ng s


- R al ib

c kh trùng

- B sung 400 µl NaOH 2N r i
- Ch nh pH v 6 7
- B sung dung d ch 25:24:1 theo t l 1:1
- Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút
- Thu d ch trong
- B sung Etanol 100% + Natri Axetat NaOAc 3M
-

trong t -200C trong 30 phút

- Ly tâm thu t a
- R a l i t a b ng c n Etanol 700
- Ly tâm
- Làm khô và hòa tan l i b

c
17

c


2.4.2.

ng ADN tách chi t b

k


n

axit nucleic trong m

n

50 µg/ml ADN s i kép. Do v y, n

nh
OD260

As

ng v i

c tính theo công th c:

CDNA = OD260 x 50 x d
:d=

pha loãng m

ADN

; CADN =N

Tuy v y, cách tính trên ch chính xác khi dung d ch axit nucleic là s ch, n u dung
d ch ch a ADN còn có l n protein ho c 1 s dung môi, hóa ch t tách chi t thì protein
h p th ánh sáng

m c a quá trình sao chép ADN v i s tham gia c a m t lo i

enzym DNA polymerase ch u nhi

n ng n ADN m t s i làm m i và dùng

n ADN m
kh

t ng h p nên s i m i b sung v i nó. Vì v y

u quá trình t ng h p ADN c n cung c

t 6

nm

dài

n này g n k t v i ADN khuôn t

c enzym DNA polymer
s i ADN m
900C (92

u khi

u sao chép, và

t ng h p nên m t s


c ch n n m
cb

ut im

n
ng cho
n ADN c n

n m i và kéo dài


v

n m i n m trên s i kia, cho s n ph

dài n m gi

dài c a s n ph m PCR có th t
ngàn c

n hàng ngàn, th m chí hàng ch c

y, sau m i chu k ,

hi n trên m i s i ADN m

n m i l i xu t



nguyên lý ph n ng PCR
PCR là m t k thu t phòng thí nghi
V t li u kh
Không ph

ng d ng h t s c r ng rãi.

u cho PCR là ADN có ch

n c n nhân lên, g i là khuôn ADN.

n thi t ph i tách chi
n m i dùng trong ph n

khi t thì ph n ng PCR s r t nh

n c n nhân lên vì vi

nh. Tuy nhiên n u ADN làm khuôn tinh
c hi

ng PCR r t nh . Trong các thí nghi

ng ADN khuôn c n cho ph n
ng

19

phòng thí nghi m ch c n 1


c tinh khi t (không có DNAase; RNase v.v...)

- Dung tích t ng s cho m t ph n ng PCR là 50 l ho c 25 l.
u ch nh nhi

) cho 1 chu k (Hình 2.3).

Bung liên k t c

c th c hi n

n vài phút. T i nhi

nhi

90 C - 98 C

này, các phân t ADN m ch kép s b tách ra

t o nên các s

n m i bám vào và enzym RNA

Polymerase xúc tác t ng h p.
M i bám (hay còn g i là

v im i

c h xu ng 37

y, ph n ng x y ra trong 25

cu i cùng. Sau chu k cu i, nhi
c các s
nhi

40 chu k và ti p t

c duy trì

72 C trong 5

n chu k
10 phút sao cho t t

n ng xo n l i t o nên s n ph m PCR. Cu i cùng,
h xu ng 4

b o qu n s n ph m.

S n ph m c a ph n
ki m tra b ng cách ch
PCR s

n ADN mà ta c n nhân lên. S n ph
n di trên th ch agarose (n

c nhìn th

c

m

ng nucle

d ng thêm 4 lo i dideoxynucleotit (m t nhóm dideoxynucleotit không còn kh
nucleotit ti p theo d

i

ng còn s
u này khi n các

u n i photphodieste v i các

n làm ng ng quá trình t ng h p ADN. Hình 2.4.

21


Hình 2.4. Nguyên lý gi i trình t
(esciencecentral.org)
2.4.5.

ng d li u trình t

Các thông s và d li u thu nh

c trình t

b ng ph n m m BioEdit. Ph n m m này cho ph

n xong vi

nh ng l i mà các ph n m m không th t

c trình t b ng máy v n có

ng s a, vì v y d a trên các bi

th tín hi u, chúng tôi th c hi n ki m tra th
n a b ng m

ng t t

ng và thay th

nh c a tín hi u m t l n
c không th

g i nh m (Hình 2.6).

23

hi n

nh ho c


L i nh n bi t tínhi u sai

Hình 2.6. Ki m tra ch


24

t
các cá


3.1. Tách chi t ADN t ng s t m u sinh ph m
ADN t ng s là nguyên li

n c a ph n ng PCR, vì v y ch

quy

n ch

t ng s

tinh s ch cao, tr ng thái không b

ng c a nó

ng c a ph n ng PCR và các k t qu thí nghi m sau này. ADN
t gãy và có n

cho quá trình th c hi n ph n ng PCR hi u qu và t

h p lý c n thi t

t t cho các công vi c ti p

()

c công b

th c hi

t i Ngân hàng Gen

c thi t k m i và so sánh trình t .

Thi t k m i
M i là nh

n nucleotit m

ct 6

b t c p b sung v i trình t khuôn

100 bp, có trình t

u m

i m i là m i xuôi

(primer forward) và m

c (primer reverse) tham gia vào PCR.

M i xuôi b t c p và g

c công b trong Ngân hàng Gen qu c t (GeneBank), s
c g i là trình t Anderson.
().
361 acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac
421 ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat

H408

481 ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata
541 ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa
601 ccactcacgg gagctctcca tgcatttggt attttcgtct ggggggtgtg cacgcgatag
661 cattgcgaga cgctggagcc ggagcaccct atgtcgcagt atctgtcttt gattcctgcc
721 tcatcctatt atttatcgca cctacgttca atattacagg cgaacatact tactaaagtg
781 tgttaattaa ttaatgcttg taggacataa taataacaat tgaatgtctg cacagccgct
841 ttccacacag aaaaaatttc acatcataac caccaaaccc cccccctccc cccgcttctg
910 gccacagcac ttaaacacat ctctgccaaa ccccaaaaac aaagaaccct aacaccagcc
15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga
15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct

L15977

16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca
16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat.
Theo tính toán trên, c p m i thi t k s nhân b
Loop v

n DNA trong vùng D

c kho ng 1000 bp.