ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HUẾ - 2014


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VÕ CHÂU TUẤN

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO
CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)
VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÍCH LŨY MỘT SỐ
HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
Mã số: 62.42.30.05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc

trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tác giả
Võ Châu Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................... 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ................................................. 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................ 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ................................................................... 5
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ............................................... 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật ..................................................... 6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus .................................................................................. 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào ................................................................ 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ............... 10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................ 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................ 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC
VẬT NUÔI CẤY IN VITRO................................................................................... 19

2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu .................................. 43
2.3.9. Xử lý thống kê ....................................................................................... 43
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................ 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC .............. 47
3.2.1. Ảnh hƣởng của cỡ mẫu nuôi cấy ......................................................... 47


3.2.2. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc .................................................................... 49
3.2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST ................................................................. 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA .......................................................................... 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D ...................................................................... 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ........................................................... 52
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose ................................................................... 54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose ................................................................... 56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN ..................... 59
3.3.1. Khảo sát sinh trƣởng của tế bào ......................................................... 59
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................ 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy ................................................................................... 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí ......................................................... 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ......................................................... 65
3.4.1. Hàm lƣợng tinh dầu ............................................................................. 65
3.4.2. Hàm lƣợng polysaccharide hòa tan trong nƣớc tổng số ................... 67
3.4.3. Hàm lƣợng curcumin ........................................................................... 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................ 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ... 77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 80


DMSO

:

dimethyl sulfoxide

ĐC

:

đối chứng

ĐHST

:

điều hòa sinh trưởng

HPLC

:

high performance liquid chromatography
(sắc ký hiệu năng cao áp)

IAA

:


lipopolysaccharide

MS

:

Murashige và Skoog (1962)

NAA

:

naphthaleneacetic acid

Nxb

:

nhà xuất bản

TNF-α

:

tumor necrosis factor-alpha

2,4-D

:


13

Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát
sinh hình thái của callus
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi
cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế
bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L

Trang
44


Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi
cấy trong hệ lên men 10 L
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L

66

67

69

Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene
17

trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự

74

nhiên
18

Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen

78


DANH MỤC CÁC HÌNH

47
55

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình
6

tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và

58

1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút
7
8

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml
đặt trên máy lắc
Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L

59
60

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men
9

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5
mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu

60

100 g

18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít

72

73

Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự
15

nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2

76

đến 18 ngày
16

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen

77


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là
nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực
vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược
phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc
các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như

các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi
thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất
về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật
ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các
chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương
đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài
tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất
nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn
như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus
roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea
doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi
Panax… [163].
Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn
gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á,
Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa
các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó
còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82].
Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u;
một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và
ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông
máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức


3

chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng
bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có
tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó,
polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt

huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối,
cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị
cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in
vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống
các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn
định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên
men 10 L.
- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu,
curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy.
Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các
hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển
hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy
huyền phù tế bào cây nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào
cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức
chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao
hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.


5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ
quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro

berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177].
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật
Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền
của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành
lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào
độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12].
1.1.2.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy
các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn
là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính
xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên
khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối
ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng
trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh
trưởng [93].
Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng
soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên
được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại


7

trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque
và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của
chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số
dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây