Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2.Mục đích và nội dung nghiên cứu 1
1.2.1.Mục đích 1
1.2.2.Nội dung nghiên cứu 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1.Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2
2.1.1.Khái niệm 2
2.1.2.Phân loại 2
2.2.Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) 14
2.2.1.Tổng quát về TLC 14
2.3.Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 22
2.3.1.Khái niệm 22
2.3.2.Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 23
2.3.3.Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh
học 27
Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
(Mulbagal and Tsay 2004) 30
2.4.Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 33
2.4.1.Mô tả cây 33
2.4.2.Phân bố, thu hái và chế biến 34
2.4.3.Thành phần hóa học 34
2.4.4.Tác dụng dược lý 35
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37
3.1.Thời gian và địa điểm thí nghiệm 37
3.2.Vật liệu 37
3.2.1.Đối tượng nghiên cứu 37
3.2.2.Trang thiết bị và dụng cụ 38
3.2.3.Các loại hóa chất sử dụng 38

4.3.1.Khảo sát sự hiện diện flavonoid 55
4.3.2.Khảo sát sự hiện diện triterpenoid 58
4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 61
ii
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
4.4.1.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng
phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 61
4.4.2.Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch 62
4.4.2.1.Đối với E.coli 63
4.4.2.2.Đối với Samonela 64
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
5.1.Kết luận 66
5.2. Kiến nghị 67
CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
ii
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra
một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di
truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các
phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuất
chúng ở quy mô thương mại.
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng
nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển
không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường
sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi
cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và
phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất

2
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp
thành những nhóm khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường
không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường
không rõ ràng.
2.1.2.1. Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ.
Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R
(mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito.
Các alkaloid chia thành ba loại:
 Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base,
thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và
hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ.
 Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin
và N, N–dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ
các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn.
 Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao
gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid.
2.1.2.2. Flavonoid
 Khái niệm
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nữa
rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong
dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác
định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc
-OCH
3
thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu
vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh,
tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật

Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân
trên. Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B
đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp
chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ.
Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan
 Phân loại flavonoid
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ
oxy hóa của mạch 3C. Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở
vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C
– 4. Người ta còn phân biệt biflavanoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu
tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một
phần cấu trúc ligan.
 Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4–
ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon,
chalcon, auron.
 Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene,
isoflavan – 4 –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3–
arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,
homoisoflavon. Isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceac.
5
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
 Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: 4–
arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion.
 Biflavonoid và triflavonoid: những flavonoid dimer và trimer. Những hợp
chất này được gọi là proanthocyanidin. Ở đây những biflavonoid tạo thành từ
flavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon.
 Sự phân bố flavnoid trong thực vật
Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện
được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhóm
anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.

nhóm carbonyl nên không màu.
Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường. Tuy
nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp
với các sắc tố khác.
Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là
những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được
trong nước tốt nhất là cồn. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu
7
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavnoid có nhóm 7–hydroxy thường đễ tan
trong dung dịch kiềm loãng.
 Tác dụng sinh học của flavonoid
Các dẫn chất flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do như -HO, -ROO.
Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì
sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư,
tăng nhanh sự lão hóa. Thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của một số flavonoid
theo thứ tự: myriceum > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin >
apigenis > catechin > 5,7 dihydroxy–3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon > robinin >
kaempferol > flavon.
Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này
là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có 3, 5, 3’, 4’ hydroxyl có khả
năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonxyl hoặc
3’, 4’ orthodioxyphenol.
Thành phần của màng tế bào có các hoạt chất lipid dễ bị peroxyde hóa, tạo ra
những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng như đến sự hủy hoải tế bào. Đua
các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có ngăn ngừa
các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ,
thoái hóa gan…
Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của
enzyme oxy hóa – khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase. Enzyme

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol
thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparosid trong Sarothammus scoparius,
lespecapitosid trong Lespedeza capiata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoid của cây
râu mèo đều có tác dụng thông tiểu.
Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã
được ứng dụng để chữa đau dạ dày. Một số dẫn chất khác như catechin, 3–O– methyl
catechin, naringennin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét.
Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavonon,
dihydroflavonol, anthocyanin, flavan–3–ol , chalcon, isoflavon, biflavon, 4–aryl
coumarin, 4–aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất
flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin.
Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucodephinidin, quercetin, catechin để điều trị ban
đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị.
Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan–3– ol,
anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelarrgonin, hỗn hợp catechin của trà có
9
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích của tim, thí nghiệm làm hồi phục
tim khi bị ngộ độc bởi CHCl
3
, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp.
Cao chiết từ lá cây bạch quả (Ginko biloba) chứa các dẫn xuất 3–rutinosid của
kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và
isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ
“Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh
mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí
nhớ, khả năng làm việc trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt.
Trên hệ thần kinh, một số C– lavon glycoside của hạt táo – Ziziphus vulgaris
var. spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng
an thần rõ rệt.

abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người
ta dùng ba dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate,
barihydroxyd, ammoni sulfate. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất
này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và
dẫn xuất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin.
Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có
loại trung tính và loại kiềm. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia
ra: saponin triterpenoid và saponin steroid.
 Cấu trúc hóa học
 Saponin triterpenoid
Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen. Người
ta chia àm 2 loại:
+ Saponin triterpenoid pentacyclic: chia ra làm các nhóm: olean, ursan, lupan.
Hình 2.6: (1) olean, (2) ursan
+ Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính: dammaran, lanostan,
cucurbitan.
11
(1) (2)
(3)
(4)
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Hình 2.7: (3) dammaran, (4) lanostan
 Saponin steroid
+ Nhóm spirostan
Hình 2.8: spirostan
+ Nhóm furostan
Hình 2.9: furostan
+ Nhóm spirosolan
Hình 2.10: spirosolan

L–arabinose, L–rhamnose, D–xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và
một số đường khác.
+ Phần aglycon của glycosid: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại
hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid,
iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,
2.1.2.5. Hợp chất phenol
Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có
vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy – OH. Trong thiên nhiên, các
hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, các
polyphenol (ligin, tanin, ).
Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở
dạng glycosid. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể đựa vào đặc
điểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây cỏ.
Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzmye phenolase vốn luôn
có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol giúp hạn chế tác
dụng của enzyme này.
Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là
phenylamin, tyrosin, tryptophan. Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứng
phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chất
phenol.
13
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
2.2. Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC)
2.2.1. Tổng quát về TLC
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước để tách các phẩm
nhuộm từ cây cỏ. Đến thập kỷ 1930 – 1940, phương pháp này được phát triển nhanh
chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau. Có các loại sắc ký: sắc ký giấy (kỹ thuật sớm
nhất, hiện nay ít được sử dụng vì hiệu quả tách kém thua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng),
sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệu
năng cao, điện di.

ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu
chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di
chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.
2.2.1.1. So sánh TLC với kỹ thuật sắc ký khác
Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích
(vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết
ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau.
So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kết
quả kém hơn do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nên
quá trình thực hiện phải kéo dài, dẫn theo kết quả không tốt. Tiếp theo, kỹ thuật sắc
ký lớp mỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sử
dụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng các
chất ra khỏi hỗn hợp ban đầu, đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng,
tuy vật vẫn mất thời gian. Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho kết
quả nhanh, tốt, cả về mặt định tính lẫn định lượng nhưng máy rất đắt tiền, không phải
phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị.
Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký
Sắc ký lớp
mỏng
Sắc ký cột
cổ điển
Sắc ký cột
chớp
nhoáng
Sắc ký khí Sắc ký
HPLC
Cơ chế sắc
ký
Hấp thu /

Vài phút
đến vài giờ
Nhiều giờ Vài mươi
phút
Vài phút Vài phút
Hiệu quả
tách chất
định tính
Rất tốt Cần sắc ký
vài lần
Cần sắc ký
vài lần
Rất tốt Rất tốt
Hiệu quả
tách chất
định lượng
Có thể Cần sắc ký
vài lần
Cần sắc ký
vài lần
Rất tốt Rất tốt
Khả năng
tách lượng
lớn mẫu
Có thể Rất tốt Rất tốt Có thể,
nhưng rất
khó
Rất tốt
2.2.1.2. Ưu điểm của TLC
Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm.
Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm,
rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly; điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch pha
mẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém.
Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫu
này, mỗi dung dịch mẫu chấm lên cùng một bản, vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở
ngoài bìa phải các bờ cạnh 1.5 cm (đối với có kích thước 20 x 20cm).
Với bản sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu sẽ được chấm lên bản
thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát. Có thể áp dụng khoảng 10 mg
cho một bản có kích thước 20 x 20 cm và chiều dầy bản 5mm. Trên mức kết thúc
dung môi (cách bờ cạnh trên 0.5 – 1 cm), nên dùng một đầu viết chì vót nhọt vạch
một đường hằn xuống lớp hấp thu. Làm như thế, khi dung môi giải ly đi lên đến đầu
trên sẽ bị buộc phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau.
Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình,
nên lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuyếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làm
các vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra.
Ngoài ra, các nhà xản xuất có bán sẵn các thiết bị tự động để chấm mẫu lên
lớp mỏng. Các loại thiết bị này giúp chấm dung dịch mẫu lên lớp mỏng với lượng thể
tích xác định chính xác.
2.2.2.2. Giải ly bản mỏng
17
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản
mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá
trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ
nhỏ nhất.
Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng định
tính, chỉ cần một thể tích koảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dầy của lớp dung
môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bản
mỏng cách bìa là 1cm.

Nếu sử dụng bản mỏng thương mại ví dụ silica gel 60 F254, bản mỏng này là
silica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa)
hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, như vậy dưới ánh sáng 254 nm, tấm bản sẽ có
màu xanh lục chói. Nếu trên tấm bản có một vết của hợp chất mà hợp chất này cũng
hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, vết này sẽ che mất huỳnh quang, xuất hiện là
một vệt tối trên nền sáng.
Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất
phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu.
 Một số điểm cần lưu ý:
Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng khi sử dụng
cẩn thận vì máy này không có thùng che chắn tia UV giống như dụng cụ nói trên,
nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gen.
Bản mỏng với chất hấp thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang có thể
gây nên sự thay đổi vị trí của các vết trên bản: vết ở đúng vị trí này nhưng lại nhìn
thấy vết ở ví trí khác, điều này gây nên nhưng nhầm lẫn tai hại.
 Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa
thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản
mỏng. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. Các
thuốc thử được xếp thành 2 loại: đặc trưng và không đặc trưng.
Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với các loại hợp
chất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamin B, chất chỉ thị phát huỳnh
quang.
Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những
nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng. Thí dụ: thuốc thử
dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl để tạo
màu đỏ đậm.
 Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng
Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phải
thấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách.

Đặt tấm bản mỏng dưới một tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm,
nhạt, vị trí vết.
+
Photocopy lại tấm bản mỏng.
20
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
+
Tốt nhất là chụp hình màu để lưu lại hình ảnh nguyên tấm bản với đầy đủ màu
sắc của các vết.
2.2.2.5. Ứng dụng của TLC
 Để công bố các đặc điểm của một hợp chất
Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf không
đổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất
định.
Muốn đo Rf sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và
của dung môi. Rf là tỉ số giữa đoạn đường di chuyển của hợp chất và đoạn đường di
chuyển của dung môi, là con số không có đơn vị, luôn luôn nhỏ hơn một (Rf< 1).
Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy.
Hình 2.12 hình minh họa bản sắc ký
Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mức
xuất phát đến tâm của vết đo. Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc ký bản mỏng
lại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn.
Giá trị Rf của hợp chất thay đổi tùy theo nhiều yếu tố:
+
Loại bản mỏng silica gel hoặc alumina của hãng Merk hay Prolabo (bản mỏng
tráng sẵn dù của cùng một hãn sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản xuất).
+
Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau.
+
Độ dầy của bản.

để có: một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển gần với mức xuất phát; một hệ dung
môi đẩy vết di chuyển đến khoảng giữa bản và một hệ dung môi đẩy vết di chuyển
xa với mức xuất phát.
Nếu cả ba bản lúc nào cũng cho thấy vết tròn, gọn là mẫu tinh khiết, còn chỉ cần
một bản có thêm các vết khác, là mẫu có lẫn bẩn, cần tinh chế thêm.
2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp
2.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp
chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất
chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm
gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết
22

Trích đoạn Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân

---