VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THANH THỦY

GIÁM ĐỊNH ADN NGƯỜI TỪ MẪU LẪN
TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THANH THỦY

GIÁM ĐỊNH ADN NGƯỜI TỪ MẪU LẪN
TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ THU THỦY

HÀ NỘI - 2017


2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 5
1.1. Định nghĩa mẫu lẫn ................................................................................ 5
1.2. Tình hình giám định mẫu lẫn .................................................................. 7
1.2.1. Trên thế giới ..................................................................................... 7
1.3. Các trường hợp mẫu lẫn, nhiễm thường gặp .......................................... 9
1.3.1. Các trường hợp mẫu lẫn thường gặp:............................................... 9
1.3.2. Các trường hợp mẫu nhiễm thường gặp: ....................................... 10
1.3.3. Biện pháp hạn chế xảy ra tình trạng mẫu nhiễm ............................ 10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 12
2.1. Vật liệu .................................................................................................. 12
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ............................................................................. 12
2.1.2. Hóa chất.......................................................................................... 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 13
2.2.1. Phương pháp thu lượm dấu vết mẫu lẫn ........................................ 13
2.2.2. Tách chiết ADN từ các dấu vết mẫu lẫn ........................................ 14
2.2.3. Định lượng ADN từ các dấu vết mẫu lẫn....................................... 15
2.2.4. Nhân bội ADN từ các dấu vết mẫu lẫn .......................................... 16
2.2.5. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary
Electrophoresis -CE) ................................................................................ 17
2.2.6. Phân tích kết quả ............................................................................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 24
3.1. Kết quả nghiên cứu ............................................................................... 24
3.1.1 Thu thập mẫu lẫn từ các vụ án hình sự ........................................... 24
3.1.2. Tách chiết ADN mẫu nghi lẫn ....................................................... 25


3.1.3. Định lượng ADN ............................................................................ 28
3.1.4. Nhân bội ADN ............................................................................... 30


LR

: Likelihood ratio (tỉ lệ khả dĩ)

RFU

: Relative fluorescent units (đơn vị huỳnh quang tương đối)

PCR

: Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen)

STR

: Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn)

VNTR

:Variable number tandem repeats (đoạn lặp có độ dài trung
bình)

RFLP

: Restriction fragment length polymorphism (đa hình chiều dài
đoạn cắt giới hạn)

PAT

: Peak amplitude threshold (ngưỡng biên độ đỉnh)

quan trọng trong các vụ án hình sự, bởi lẽ con người luôn là đối tượng bị xâm
hại cũng là đối tượng gây ra dấu vết. Từ những dấu vết sinh học để lại trên
hiện trường qua công tác giám định ADN (forensic ADN analysis) có thể truy
nguyên cá thể người (Human Identification) trong các vụ án hình sự, xác định
quan hệ huyết thống (Paternity Testing), truy tìm tung tích nạn nhân, người
mất tích trong các vụ cháy, tai nạn, thảm họa, xác định hài cốt chưa rõ tung
tích như giám định hài cốt liệt sĩ... Không những vậy, giám định ADN còn là
một phương pháp hữu hiệu để truy tìm các đối tượng phạm tội thông qua lưu
trữ thông tin các cá thể (tàng thư gen tội phạm) phục vụ công tác đấu tranh
phòng chống tội phạm của lực lượng CAND. Đối với các vụ án mạng thì
thông qua giám định ADN có thể chứng minh sự tác động qua lại giữa đối
tượng và nạn nhân.
ADN của đối tượng để lại trên người hoặc quần áo nạn nhân.
ADN của đối tượng để lại trên đồ vật, hung khí hoặc tại hiện trường.
ADN của nạn nhân để lại trên người hoặc quần áo của đối tượng.
ADN của nạn nhân để lại trên đồ vật, hung khí hoặc tại hiện trường.


2

ADN của nhân chứng để lại trên nạn nhân, đối tượng, thậm chí là trên đồ
vật, hung khí hoặc tại hiện trường.
Từ các mẫu dấu vết sinh vật thu được ở hiện trường và đối tượng nghi
vấn thông qua việc giám định ADN sẽ giúp cơ quan điều tra truy nguyên
được cá thể người. Thông qua tiến hành tách chiết ADN từ mẫu dấu vết sinh
vật thu được ở hiện trường và mẫu so sánh. ADN sau khi tách chiết từ vật
mang được tiến hành định lượng, tinh sạch và nhân bội, điện di và phân tích
kết quả. Phương pháp giám định ADN đảm bảo độ chính xác gần như tuyệt
đối. Theo tính toán của các nhà giám định, nếu phân tích từ 9 tổ hợp gen trên
ADN người thì trên 70 tỷ người mới có thể có người trùng lặp kiểu gen.

quá trình phân tích, đòi hỏi trình độ và kinh nghiệm của giám định viên. Đặc
biệt, việc phân tích kết quả của dấu vết mẫu ADN lẫn có thể gây ra những
thách thức, khó khăn cho cho các giám định viên. Nếu phân tích sai có thể
gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình điều tra, đặc biệt là trong giai đoạn
định hướng điều tra, gây bỏ sót, bỏ lọt tội phạm, oan sai. Quá trình giám định
các dấu vết, mẫu vật bị lẫn luôn đặt ra những khó khăn thách thức cho các
giám định viên trong quá trình phân tích kiểu gen. Để góp phần khắc phục
những sai sót và nâng cao khả năng phân tích các mẫu lẫn, tác giả chọn đề tài
nghiên cứu “Giám định ADN người từ mẫu lẫn trong các vụ án hình sự”
là một yêu cầu cấp thiết trong tình hình hiện nay.
2. Mục tiêu đề tài
2.1. Hoàn thiện phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết mẫu lẫn trong
các vụ án hình sự.
2.2. Hoàn thiện phương pháp phân tích kết quả trong giám định ADN
trong trường hợp phân tích dấu vết mẫu lẫn phục vụ công tác thực tiễn cũng
như công tác nghiên cứu và giảng dạy.


4

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập các dấu vết nghi mẫu lẫn trong các vụ án hình sự được
trưng cầu bởi Cơ quan CSĐT - Công an các địa phương gửi đến giám định tại
Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an trong thời gian từ tháng 8/2016 đến
tháng 4/2017.
3.2. Tách chiết ADN từ các dấu vết mẫu lẫn đã thu thập được trong các
vụ án hình sự.
3.3. Nhân bội ADN.
3.4. Điện di.
3.5. Phân tích kết quả.


6

kiểu gen (ADN) của một người, nhưng có nhiều trường hợp tại một vị trí dấu
vết lại cho kết quả kiểu gen (ADN) của nhiều người khác nhau.
Dấu vết ADN bị lẫn làm cho việc phân tích, giải thích kết quả gặp khó
khăn. Dấu vết mẫu lẫn trong các vụ án hình sự bao gồm ADN của nhiều
người, mức độ đóng góp của mỗi người khác nhau, người để lại nhiều, người
để lại ít tế bào. Ngoài ra các mẫu lẫn có thể bao gồm ADN của nhiều người
nhưng đều chỉ ở mức vi vết rất nhỏ. Kiểu gen (ADN) thu được của duy nhất
một người có thể bị xử lý như là một mẫu lẫn khi đỉnh của stutter (alen lặp)
cao và do đó nếu không biết cách phân tích, đồng thời dựa vào nội dung và
tình tiết vụ án thì có thể dẫn tới việc giải thích sai vì xem đó là kết quả kiểu
gen (ADN) của nhiều cá thể, đồng nghĩa với việc ra kết luận vụ án bị sai, gây
khó khăn cho công tác định hướng điều tra và truy tố, xét xử tội phạm. Với
xác suất cao của alen bị mất đi hoặc bị lặp lại, việc xác định số lượng người
để lại tế bào chứa ADN trong mẫu lẫn là một vấn đề khó khăn. Tăng cường
các phản ứng khuếch đại có thể làm cho alen trong kiểu gen (ADN) phân tích
được ít bị mất đi hoàn toàn ở một vài locus hoặc có thể gây ra sự khuếch đại
thêm một số alen, tạo ra sự xuất hiện kiểu gen (ADN) của một người khác
riêng biệt. Đặc biệt việc tăng stutter (alen lặp) nhìn thấy được khi thực hiện
phản ứng khuếch đại ADN từ các dấu vết gây khó khăn cho việc phân tích
mẫu lẫn.
Như vậy, mẫu lẫn được hiểu là các dấu vết sinh vật thu được trong quá
trình khám nghiệm hiện trường, khám nghiệm tử thi như: Dấu vết máu, mô,
cơ, dấu vết tế bào biểu bì da, dấu vết tinh trùng, lông, tóc, tế bào niêm mạc
miệng trong dấu vết nước bọt tại một vị trí hoặc ở các vị trí khác nhau của
một mẫu vật gửi giám định mà sau khi chạy điện di sẽ cho kết quả kiểu gen
của những người khác nhau (ít nhất là hai người) trong cùng một bảng kiểu
gen (ADN).



8

bộ làm công tác giám định được đào tạo từ Úc. Bằng bộ Kit phân tích 10
locus gen (trong đó có 01 gen xác định giới tính) trên máy ABI Prism 377 của
hãng Perkin - Elmer. Ngoài giám định ADN từ nhân tế bào để truy nguyên cá
thể và xác định quan hệ huyết thống cha - con. Năm 2003, Viện Khoa học
hình sự đã triển khai thêm lĩnh vực giám định ADN ti thể với máy giải trình
tự ABI 310 để giám định hài cốt liệt sĩ và gia đình quan hệ huyết thống theo
dòng mẹ từ hài cốt trong các vụ án hình sự và hài cốt liệt sĩ. Năm 2006, Viện
Khoa học hình sự đã trang bị thêm máy giải trình tự ABI Prism 3130 Genetic
Analyzer có khả năng phân tích 16 locus STR hệ Identifiler. Ngoài ra, một số
đơn vị khác cũng triển khai nghiên cứu một số cặp mồi đơn gen để nghiên
cứu giới tính và các cặp mồi D1S80, TH01…để nghiên cứu đặc thù cá thể và
các cặp mồi với một số đoạn ADN đa hình nằm trên nhiễm sắc thể Y vào mục
đích xác định huyết thống.
Bộ kit Identifiler có 16 gen gồm các gen: D8S1179, D21S11, D7S820,
CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA,
TPOX, D18S51, D5S818, FGA và Amelogenin [3].
Theo các nhà khoa học hình sự khi phân tích bằng bộ kít Identifiler thì
độ tin cậy trung bình đạt khoảng 4,62x1019 có nghĩa là trong số 4,62x1019
người thì có một người ngẫu nhiên nào đó trùng với kiểu gen trên.
Hiện tại ở Việt Nam ngoài Trung tâm Giám định sinh học pháp lý - Viện
Khoa học hình sự - Bộ Công an có chức năng giám định ADN để phục vụ
công tác điều tra, xét xử tội phạm thì còn có một số đơn vị cũng có chức năng
nghiên cứu và giám định ADN như: Viện Pháp y quân đội, Viện pháp y Quốc
gia, Viện công nghệ sinh học. Tuy nhiên, hiện tại chưa tìm thấy công trình
nghiên cứu và tài liệu nào liên quan đến việc giám định mẫu ADN lẫn từ các
cơ quan, đơn vị trên.

10

g. Trong các vụ hiếp dâm, giao cấu trái ý muốn dẫn đến có thai, trường
hợp nạo bỏ thai nhi sẽ có lẫn mẫu thai nhi lẫn nhau thai của mẹ.
Mẫu bị lẫn có thể ở tại một vị trí do hai hoặc nhiều người khác nhau để
lại hoặc có thể trong trường hợp ở các vị trí khác nhau trong cùng một mẫu
gửi giám định nhưng do lượng dấu vết ít nên giám định viên lấy dấu vết ở các
vị trí khác nhau cho vào một ống để tách chiết và PCR.
1.3.2. Các trường hợp mẫu nhiễm thường gặp:
a. Trước khi hành động tội phạm xảy ra;
b. Trong khoảng thời gian giữa hành động phạm tội và bảo vệ hiện
trường vụ án;
c. Trong quá trình khám nghiệm hiện trường, thu và bảo quản dấu vết,
mẫu vật không đảm bảo dẫn đến bị lẫn mẫu của nhiều người như của cán bộ
khám nghiệm, điều tra viên, người tham gia cấp cứu, người thu mẫu…
d. Trong quá trình chuyển dấu vết, mẫu vật vào ống nghiệm, quá trình
tách chiết do giám định viên không tuân thủ đúng qui trình phòng thí nghiệm.
1.3.3. Biện pháp hạn chế xảy ra tình trạng mẫu nhiễm
Để giảm thiểu nguy cơ nhiễm ADN ở hiện trường vụ án, cần thực hiện
nghiêm ngặt các điều sau đây:
a. Hạn chế thâm nhập vào nơi có dấu vết;
b. Sử dụng găng tay, khẩu trang, xem xét chặt chẽ những mẫu vật có liên
quan đến tội phạm;
c. Thay đổi thường xuyên găng tay khi thu thập dấu vết;
d. Tránh tối đa việc tiếp xúc, va chạm vào khu vực có dấu vết;
e. Phân tích sẵn kiểu gen (ADN) của những người tiếp xúc dấu vết, mẫu
vật và các giám định viên trong phòng thí nghiệm. Những dữ liệu này sẽ được
đem ra so sánh khi có dấu hiệu của mẫu lẫn, nhiễm.



Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
a. Thiết bị máy móc
- Máy cất nước hai lần (Trung Quốc)
- Tủ hút vô trùng (Đức)
- Tủ sấy (Đức)
- Tủ lạnh (Nhật)
- Máy điều nhiệt (Eppendorf - Đức)
- Block gia nhiệt
- Block heater của hãng Selby - Australia, gồm hai loại đơn và đôi
- Máy ly tâm Universal 320 và Micro 200R của CH liên bang Đức có
vận tốc li tâm tối đa là 15.000v/phút
- Máy định lượng 7500 Realtime PCR System của hãng AB - Mỹ phục
vụ định lượng ADN
- Máy điều nhiệt 9700 của hãng ABI - Mỹ phục vụ chạy nhân bội PCR
- Máy điện di mao dẫn 3130 Genetic Analyze của hãng ABI - Mỹ sử
dụng phần mềm của hãng Hitachi - Nhật Bản.
b. Dụng cụ
- Pipet định mức các loại (Gilson, Eppendorf)
- Ống Eppendorf các loại: 0,2ml; 0,5ml; 1,0ml; 1,5ml
- Đầu côn các loại 10µl, 100µl, 200µl, 1µl


13

- Găng tay cao su chuyên dụng, khẩu trang, panh, kéo.
- Các dụng cụ tiêu hao phục vụ quá trình nghiên cứu và giám định như
hệ thống mao quản (capillary), Gel-POP4 và các loại ống nghiệm, khay đựng

Khoa học hình sự - Bộ Công an áp dụng hai phương pháp tách chiết chính là:
a. Phương pháp tách chiết bằng bộ kít prepfiler.
b. Phương pháp tách chiết bằng chelex.
Tùy theo chất lượng dấu vết mà áp dụng tách chiết theo phương pháp nào
cho phù hợp để thu được kết quả ADN cao đối với dấu vết mẫu lẫn. Những vụ
dấu vết có chất lượng kém, lượng dấu vết ít thì được áp dụng phương pháp tách
chiết bằng bộ kít prepfiler. Các dấu vết, mẫu vật có chất lượng tốt và lượng dấu
vết thu được nhiều thì được áp dụng phương pháp tách chiết bằng chelex.
Nguyên lý: Các mẫu có nguồn gốc sinh học (máu, tinh dịch, nước tiểu…)
thu được ở hiện trường, đối tượng và nạn nhân có chứa ADN và nhiều chất
khác. Trong tế bào, protein bao quanh sợi ADN có tác dụng bảo vệ sợi ADN
nhưng lại ngăn cản việc phân tích ADN. Để tiến hành giám định ADN thì trước
tiên cần phải tách chiết để giải phòng phân tử ADN ra khỏi nhân ở dạng ít đứt,
gãy nhất để có thể loại bỏ protein và các chất khác ra khỏi phân tử.
Nguyên tắc chung:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là
protein, lipít và một số ion kim loại: ion Fe2+, Mg2+…
Bước 3: Thu nhận ADN bằng cách thu lấy dịch nổi trong đó có chứa
ADN hoặc có thể làm tủa ADN trong ethanol hoặc izopropanol.


15

2.2.3. Định lượng ADN từ các dấu vết mẫu lẫn
Việc xác định hàm lượng ADN tách chiết được từ mẫu là rất cần thiết vì
khi biết được chính xác hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trong mẫu thì sẽ
tính được nồng độ tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR và khi đó sẽ
cho kết quả PCR tốt nhất.
Trong lĩnh vực sinh học phân tử hiện nay có nhiều phương pháp định

(target sequence) với sự tham gia của ADN - polymerase, deoxynucleotide
triphos - phate (dNTPs), đệm PCR…
Hiện tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit Identifiler plus của
hãng ABI - Mỹ là một bộ kit thương phẩm dùng cho giám định ADN. Bộ kít
nhân bội đồng thời 15 locus gen STR và 01 locus gen giới tính. Các locus gen
STR trong bộ kit này gồm: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358,
TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51,
FGA và Amelogenin (gồm cặp XX hoặc XY).
Bảng 2.1: Thành phần và thể tích phản ứng PCR
Thành phần

Thể tích

AmpFISTR® Identifiler® Plus Master Mix

5µl

AmpFISTR® Identifiler® Plus Primer Set

2,5µl

Mẫu

-

Nước

Tổng

12,5µl


Mẫu (thang alen chuẩn)

1,5µl
Tổng

11,9µl

Hỗn hợp của phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95 0C trong
3 phút, sau đấy để nhanh vào ngăn đá tủ lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính
sẽ làm cho các liên kết hiđro giữa hai mạch đơn trong phân tử ADN bị đứt
gãy, dẫn đến phân tử ADN mạch kép sẽ bị đứt thành hai mạch đơn, việc làm


18

lạnh đột ngột có tác dụng làm cho hai mạch đơn không còn khả năng kết nối
lại với nhau. Kết quả là từ phân tử ADN mạch kép sẽ chuyển thành hai phân
tử ADN mạch đơn hoàn toàn. Các phương pháp được sử dụng hoàn toàn dựa
trên các nguyên tắc khoa học, ứng dụng các thành tựu nghiên cứu tiên tiến do
đó luôn đảm bảo tính khách quan, chính xác và khoa học.
2.2.6. Phân tích kết quả
Việc xác định người tham gia đóng góp mẫu lẫn ở bất kỳ dữ liệu ADN
lẫn nào đều phải dựa trên đánh giá của toàn bộ kiểu gen như: căn cứ vào chiều
cao peak, tỷ lệ các alen, xem xét số người có khả năng đóng góp (điều này
căn cứ vào tình tiết vụ việc: số nạn nhân, số đối tượng…) để xác định xem
kiểu gen có phải là của một người hay nhiều người đóng góp hay cụ thể là tại
mỗi locus gen là biểu hiện của duy nhất một người hay của nhiều người. Một
hồ sơ ADN được xem là có hơn một người đóng góp nếu có từ ba hoặc nhiều
hơn ba alen ở một hoặc nhiều locus và tỷ số chiều cao giữa một cặp đỉnh alen