BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID
rs2681492 CỦA GEN ATP2B1 VÀ MỐI TƢƠNG
QUAN VỚI BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP Ở NGƢỜI
TỪ 40-64 TUỔI TẠI TỈNH HÀ NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID
rs2681492 CỦA GEN ATP2B1 VÀ MỐI TƢƠNG
QUAN VỚI BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP Ở NGƢỜI
TỪ 40-64 TUỔI TẠI TỈNH HÀ NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ và hai em trai đã
cho tôi động lực và luôn bên cạnh ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc làm
những gì mình yêu thích.
Hà Nội, ngày 3 tháng 4 năm 2018

Nguyễn Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU .................................................................... v
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1.

Tổng quan về bệnh tăng huyết áp ......................................................... 3

1.1.1.

Định nghĩa tăng huyết áp .............................................................. 3

1.1.2.

Chẩn đoán bệnh tăng huyết áp ....................................................... 3

1.1.3.

Phân loại bệnh tăng huyết áp ......................................................... 3

1.1.4.


1.4.

Phƣơng pháp xác định đa hình đơn nucleotid .................................... 19

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21
2.1.

Thiết kế nghiên cứu ............................................................................ 21

2.2.

Đối tƣợng nghiên cứu và tiêu chuẩn lựa chọn.................................... 22

2.2.1. Cỡ mẫu nghiên cứu .............................................................................. 22
2.2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn ............................................................................. 22

i


2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ ............................................................................... 23
2.3.

Hóa chất trang thiết bị ........................................................................ 23

2.3.1. Hóa chất................................................................................................ 23
2.3.2. Trang thiết bị ........................................................................................ 23
2.4. Thu thập thông tin về đối tƣợng nghiên cứu ......................................... 25
2.5.


3.5.

Phân tích riêng sự liên quan của gen ATP2B1 tại SNP rs2681492 đối

với nguy cơ mắc bệnh tăng huyết áp............................................................... 40
ii


3.6.

Phân tích sự liên quan của gen ATP2B1 tại SNP rs2681492 cùng với

các yếu tố xã hội, lối sống đối với nguy cơ mắc bệnh tăng huyết áp ............. 43
Chƣơng 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 45
4.1.

Quy trình kỹ thuật xác định kiểu gen ATP2B1 tại rs2681492............ 45

4.2.

Tần suất alen và sự phân bố kiểu gen của SNP rs2681492 trong gen

ATP2B1 ........................................................................................................... 45
4.3.

Ảnh hƣởng của gen ATP2B1 tại SNP rs2681492 đối với bệnh tăng

huyết áp của nhóm quần thể ở Hà Nam, Việt Nam so với một số nhóm quần
thể trên thế giới................................................................................................ 48
4.4.


DBP

Diastolic blood pressure

Huyết áp tâm trƣơng

ESH

The European Society of
Hypertension

Hiệp hội tăng huyết áp châu Âu

Global BPgen

Global BPgen

Hiệp hội Di truyền huyết áp Toàn
cầu

GWAS

Genome wide association study

Nghiên cứu liên quan toàn hệ gen

HDL

Lipoprotein Density Hight


RAA

Renin Angiotensin Aldosteron

Renin Angiotensin Aldosteron

RFLP-PCR

Restriction Fragment Length
Polymorphism

Đa hình chiều dài đoạn gen cắt giới
hạn

SBP

Systolic blood pressure

Huyết áp tâm thu

SNP

Singel nucleotid polymorphism Đa hình đơn nucleotid

WHO

World Health Oganization

iv

Hình 2.2. Hình ảnh một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu........................ 24
Hình 3.1. Chu trình thử nghiệm gradient nhiệt bằng phƣơng pháp PCR- RFLP
......................................................................................................................... 31
Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm xác định đa hình ATP2B1 rs2681492 bằng
phƣơng pháp PCR- RFLP ............................................................................... 32
Hình 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 33
Hình 3.4. Kết quả xác định kiểu gen của SNP rs2681492 trong gen ATP2B1
bằng phƣơng pháp PCR- RFLP ...................................................................... 35
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự gen ATP2B1 tại SNP rs2681492 ................... 36
Hình 4. Tần suất alen (A) và sự phân bố kiểu gen (B) của SNP rs2681492
trong gen ATP2B1 trên thế giới ...................................................................... 47

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên toàn thế giới, nhóm bệnh tim mạch là một trong các nhóm nguyên
nhân gây tử vong hàng đầu. Mỗi năm có khoảng 17 triệu ca tử vong do bệnh
tim mạch, chiếm gần một phần ba trong tổng số các ca tử vong trên toàn cầu
[81]. Trong đó tăng huyết áp là một trong những yếu tố nguy cơ hàng đầu, các
biến chứng của tăng huyết áp chiếm 9,4 triệu ngƣời mỗi năm gây ít nhất 45%
tử vong do bệnh tim [47].
Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới năm 2012, ƣớc tính có khoảng
40% ngƣời trƣởng thành đã đƣợc chẩn đoán mắc bệnh tăng huyết áp; với mức
tăng từ năm 1980 là 600 triệu ngƣời lên 1 tỷ ngƣời năm 2008 [28]. Ƣớc tính,
tỷ lệ mắc bệnh tăng huyết áp toàn cầu (12,7%) cao hơn các nguyên nhân khác
nhƣ sử dụng thuốc lá (8,7%) hay tăng đƣờng máu (5,8%). Tỷ lệ tăng huyết áp
nói chung trên thế giới là khoảng 41% ở các nƣớc phát triển và 32% ở các
nƣớc đang phát triển [82, 83]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về tăng huyết áp
cho thấy tỷ lệ tăng huyết áp đang tăng nhanh theo thời gian: 1,9% năm 1982;

Nam” với 3 mục tiêu:
1. Thiết kế quy trình xác định kiểu gen ATP2B1 tại SNP rs2681492
2. Xác định tần suất alen, sự phân bố kiểu gen của SNP rs2681492
trong gen ATP2B1 ở ngƣời từ 40- 64 tuổi tại tỉnh Hà Nam
3. Phân tích mối tƣơng quan của SNP rs2681492 đối với bệnh tăng
huyết áp ở ngƣời từ 40 -64 tuổi tại Hà Nam.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về bệnh tăng huyết áp

1.1.1. Định nghĩa tăng huyết áp
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO- World Health Organization), Hiệp
hội tăng huyết áp quốc tế (ISH- International Society of Hypertension), và
Liên Ủy ban Quốc gia Hoa Kỳ (JNC- Joint National Comittee) đã thống nhất
đƣa ra định nghĩa về tăng huyết áp: Tăng huyết áp đƣợc xác định khi huyết áp
tâm thu (SBP- Systolic blood pressure) ≥ 140 mmHg và/hoặc huyết áp tâm
trƣơng (DBP- Diastolic blood pressure) ≥ 90 mmHg [20, 88].
1.1.2. Chẩn đoán bệnh tăng huyết áp
Căn cứ hƣớng dẫn chẩn đoán và điều trị tăng huyết áp năm 2010 của
Bộ Y tế, tăng huyết áp chẩn đoán xác định dựa vào trị số huyết áp sau khi cán
bộ y tế đo đƣợc theo đúng quy trình có huyết áp tâm thu ≥ 140 mmHg
và/hoặc huyết áp tâm trƣơng ≥ 90 mmHg [1].
1.1.3. Phân loại bệnh tăng huyết áp
a. Phân độ tăng huyết áp theo chỉ số huyết áp
Hiện tại có nhiều tài liệu hƣớng dẫn phân độ tăng huyết áp theo chỉ số


< 120

và

< 80

Huyết áp bình thƣờng

120 – 129

và/hoặc

80 – 84

Tiền tăng huyết áp

130 – 139

và/hoặc

85 – 89

Tăng huyết áp độ 1

140 – 159

và/hoặc

90 – 109

Huyết áp tâm

Huyết

áp

thu (mmHg)

trƣơng (mmHg)

Huyết áp bình thƣờng

< 120

và/hoặc

< 80

Tiền tăng huyết áp

120 – 139

và/hoặc

80 – 89

Tăng huyết áp độ 1

140 – 159



và/hoặc

90 – 99

Tăng huyết áp độ 2

160 – 179

và/hoặc

100 – 109

Tăng huyết áp độ 3

≥ 180

và/hoặc

≥ 110

4

tâm


b. Phân loại tăng huyết áp theo nguy cơ tim mạch
Việc dựa vào chỉ số huyết áp không thể hiện đƣợc mức độ diễn biến
của bệnh tăng huyết áp cũng nhƣ không phản ánh đúng tình trạng bệnh lý và
khả năng tử vong vì vậy mà tăng huyết áp còn đƣợc phân loại theo các yếu tố

hoặc hội chứng bệnh

tim

tim

chuyển hóa hoặc mạch hoặc

mạch

tổn thƣơng cơ bệnh thận
quan đích hoặc mạn tính
đái tháo đƣờng

HA bình thƣờng

Nguy cơ

SBP 120 – 129 và

thấp

Nguy cơ

trung Nguy cơ rất

bình

cao


159 thấp

trung

và/hoặc DBP 90 – 99

SBP

160

–

cao

bình
Nguy

THA độ 2

Nguy cơ rất

cơ Nguy cơ Nguy cơ cao

179 trung bình

và/hoặc DBP 100 –

trung

Nguy cơ rất

tăng huyết áp, bao gồm 21,5% những ngƣời có huyết áp cao và 10,1% có
huyết áp bình thƣờng đang dùng thuốc điều trị tăng huyết áp. Trong số này,
gần một nửa (48,8%) tự báo cáo có tình trạng tim và tuần hoàn cấp và mạn
tính. Tỷ lệ mắc bệnh tăng huyết áp ở nam giới hơn nữ giới (34,1% so với
29,1%). Tăng huyết áp gặp nhiều ở ngƣời lớn tuổi, với gần 9/10 (87,7%)
ngƣời từ 85 tuổi trở lên bị tăng huyết áp [16].
Ở Anh có khoảng 16 triệu ngƣời bị tăng huyết áp [29]. Trong đó tỷ lệ
nữ bị tăng huyết áp là 30% và nam giới là 32%. Ở độ tuổi 64, tỷ lệ nam giới
bị tăng huyết áp cao hơn phụ nữ [32]. Những ngƣời có huyết áp cao thì có
nguy cơ mắc bệnh tim và đột qụy cao gấp 3 lần và có nguy cơ tử vong gấp đôi
so với những ngƣời có huyết áp bình thƣờng [31]. Khoảng 62.000 trƣờng hợp
tử vong do đột quỵ và đau tim xảy ra do không kiểm soát tốt chỉ số huyết áp
[31]. Những ngƣời bị tăng huyết áp hiếm khi có triệu chứng nào do đó 1/3 số
ngƣời bị tăng huyết áp không đƣợc phát hiện. Hơn 90% những ngƣời bị tăng
huyết áp đang điều trị không kiểm soát đƣợc chỉ số huyết áp dƣới mức 140/90
mmHg [32].
b. Tình hình bệnh tăng huyết áp ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra tổng kết Chƣơng trình Quốc gia Phòng chống
tăng huyết áp giai đoạn 2010 – 2015 trên 5454 ngƣời tại 8 tỉnh (Hà Nội, TP.
Hồ Chí Minh (đô thị), Thái Bình, Đồng Tháp (đồng bằng), Thái Nguyên, Đắc
Lắc (cao nguyên), Nghệ An, Khánh Hòa (ven biển)) trong năm 2015 thì có
47,3% trƣờng hợp tăng huyết áp trong đó số trƣờng hợp tăng huyết áp không
6


đƣợc phát hiện chiếm 39,1%; các trƣờng hợp tăng huyết áp đƣợc điều trị
chiếm 92,8 %; các trƣờng hợp tăng huyết áp chƣa đƣợc kiểm soát chiếm 69%.
Cũng theo báo cáo này thì tỷ lệ nam nữ trên 25 tuổi bị tăng huyết áp lần lƣợt
là 56,4% và 42,6%. Trong đó nữ có 4,9% bị tăng huyết áp độ 2 và 3,8% tăng
huyết áp độ 3 còn ở nam thì có 10.8% tăng huyết áp độ 2 và 6,9% tăng huyết

thu lên tới 11 mmHg và huyết áp tâm trƣơng lên 9 mmHg và kéo dài trong
20- 30 phút.
d. Các yếu tố gia đình
Nghiên cứu của các gia đình có hội chứng huyết áp cao hoặc thấp huyết
áp đã đƣợc xác định có đột biến hoặc mất chức năng trong khoảng một tá gen
điều tiết natri thận [45]. Trong gia đình nếu ông, bà, cha, mẹ bị bệnh THA thì
con cái có nguy cơ mắc bệnh này nhiều hơn. Vì vậy, những ngƣời mà tiền sử
gia đình có ngƣời thân bị THA càng cần phải cố gắng loại bỏ các yếu tố nguy
cơ mà chúng tôi đã trình bày trong bài này. Nhƣ vậy mới có thể phòng tránh
đƣợc bệnh THA.
e. Tuổi cao
Tuổi càng cao thì tỷ lệ tăng huyết áp càng nhiều, do thành động mạch
bị lão hóa và xơ vữa làm giảm tính đàn hồi và trở nên cứng hơn vì thế làm
cho huyết áp tâm thu tăng cao hơn còn gọi là tăng tâm thu đơn thuần.
f. Thừa cân, béo phì
Cân nặng có quan hệ khá tƣơng đồng với bệnh tăng huyết áp, ngƣời
béo phì hay ngƣời tăng cân theo tuổi cũng làm tăng nhanh huyết áp.
g. Ăn mặn
Chế độ ăn nhiều muối (natri clorid) thì tần suất mắc bệnh tăng huyết áp
cũng tăng cao rõ rệt. Ngƣời dân ở vùng biển có tỷ lệ mắc bệnh tăng huyết áp
cao hơn nhiều so với những ngƣời ở đồng bằng và miền núi.
h. Uống nhiều bia, rượu
Uống rƣợu, bia quá mức cũng là yếu tố nguy cơ gây bệnh tim mạch nói
chung và bệnh tăng huyết áp nói riêng. Đối với những ngƣời phải dùng thuốc
8


để điều trị tăng huyết áp thì uống rƣợu, bia quá mức hoặc nghiện rƣợu làm
mất tác dụng của thuốc hạ áp nhƣ vậy làm cho bệnh càng nặng hơn. Ngoài ra,
uống rƣợu, bia quá mức còn gây bệnh xơ gan và các tổn thƣơng thần kinh

- Tác dụng co mạch của adenalin và noradrenalin: hai chất này do tủy
thƣợng thận bài tiết ra, khi hệ giao cảm bị kích thích. Adrenalin có tác dụng
co mạch dƣới da nhƣng lại làm giãn mạch vành, mạch não, mạch cơ vân nên
chỉ làm tăng huyết áp tối đa. Noradrenalin làm co mạch toàn thân nên làm
tăng cả huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu [7].
- Vai trò của hệ RAA (RAA- Renin Angiotensin Aldosterol) [3,13]:
Renin là enzym đƣợc tế bào của tổ chức cạnh cầu thận và một số tổ chức khác
tiết ra khi có yếu tố kích thích. Yếu tố kích thích tiết renin là nồng độ muối
trong huyết tƣơng và kích thích thụ thể β của adrenergic. Khi renin đƣợc tiết
ra chuyển α2 globulin (đƣợc tổng hợp từ gan) gọi là angiotensinogen thành
angiotensin I (là peptid có 10 acid amin), theo máu đến tuần hoàn phổi đƣợc
tách khỏi chất vận chuyển và cắt đi 2 acid amin nhờ enzym chuyển dạng
angiotensin còn lại 8 acid amin đƣợc gọi là angiotensin II có tác dụng rộng
khắp toàn hệ thống động mạch, làm tăng sức cản ngoại vi và tăng thể tích lƣu
lƣợng tuần hoàn là cơ sở gây tăng huyết áp.
- Giảm chất điều hòa huyết áp: prostaglandin E2 và hệ kali krein ở thận
có chức năng sinh lý điều hòa huyết áp, hạ calci máu, tăng calci niệu khi chất
này bị ức chế hoặc thiếu gây tăng huyết áp.
- Vai trò của natri trong cơ chế bệnh sinh của tăng huyết áp: natri có vai
trò quan trọng trong bệnh tăng huyết áp cả trên thực nghiệm và trong điều trị.
Trong điều kiện bình thƣờng các hormon và thận hiệp đồng để thải natri làm
10


cho lƣợng natri trong máu ổn định. Hiên tƣợng ứ natri xảy ra thì tăng giữ
nƣớc, hệ thống mạch tăng nhạy cảm với angiotensin và noradrenalin [13].
b. Tăng huyết áp thứ phát
Bệnh nhân tăng huyết áp có nguyên nhân rõ ràng nhƣ:
- Bệnh thận ở nhu mô thận đều có thể gây tăng huyết áp thứ phát. Cơ
chế gây tăng huyết áp do thận liên quan đến thể tích lòng mạch hoặc tăng hoạt

angiotensin và làm tăng angiotensin II làm tăng cƣờng aldosteron thứ phát.
Trƣờng hợp này chỉ xảy ra ở 5% phụ nữ sử dụng thuốc và huyết áp trở lại
bình thƣờng sau 6 tháng dừng thuốc [3].
- Các nguyên nhân khác: tăng huyết áp kết hợp với tăng kali máu, bệnh
to đầu chi, tăng calci máu do cƣờng tuyến cận giáp.
1.2.

Các gen liên quan đến bệnh tăng huyết áp
Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ chính cho bệnh tim mạch, có 50%

các yếu tố góp phần gây tăng huyết áp là yếu tố môi trƣờng, 50% còn lại là do
các yếu tố thuộc về di truyền [36]. Các nghiên cứu ban đầu về tăng huyết áp
đã xác định đƣợc các enzym, các kênh, các thụ thể liên quan đến việc bài tiết
và tái hấp thu natri trong việc điều hòa tăng huyết áp bao gồm các gen liên
quan đến hệ RAA kiểm soát huyết áp và cân bằng muối nƣớc [44].
Nhiều nghiên cứu về gen đã đƣợc tiến hành để xác định mối liên quan
đối với bệnh tăng huyết áp. Năm 2009, Wang và đồng nghiệp tiến hành một
GWAS và báo cáo mối liên quan với huyết áp tâm thu tại các SNP trong gen
STK39 [77]. Org và đồng nghiệp cũng báo báo một liên quan có ý nghĩa tại 1
SNP trên gen CDH13 với huyết áp tâm trƣơng và tăng huyết áp [59]. Cùng
thời gian này, Newton- Cheh và đồng nghiệp đã xác định mối liên hệ giữa
huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trƣơng với các biến thể thông thƣờng ở tám
vùng gần các gen CYP17A1, CYP1A2, FGF5, SH2B3, MTHFR, C10orfW7,
ZNF652 và PLCD3 [57]. Trong nghiên cứu khác Newton- Cheh đã báo cáo
mối liên quan của các biến thể trong gen NPPA và NPPB với mức tăng ANP
và BNP là các peptid đƣợc biết đến với đặc tính giãn mạch [58].
12


Năm 2009, Levy và đồng nghiệp đã báo cáo các kết quả từ một nghiên

ATP2B1 gồm 20 exon với cách nối khác nhau tạo ra các đồng dạng protein
khác nhau (Hình 1.4).

14


Hình 1.3. Vị trí và cấu trúc gen ATP2B1 trên nhiễm sắc thể 12
( )

Hình 1.4. Các đồng dạng của ATP2B1
( />
15


1.3.2. Chức năng của gen ATP2B1
Gen ATP2B1 mã hóa ATPase Ca2+ màng tế bào đồng dạng 1 (PMCA1Plasma membrane Ca2+ ATPase 1). Trao đổi calcium/ calmodulin màng tế
bào phụ thuộc vào ATPase. PMCA1 có chức năng nhƣ một bơm có ái lực
cao, dung lƣợng thấp, do đó PMCA trở thành hệ thống duy nhất có khả năng
tinh chỉnh nồng độ Ca2+ nội bào [Ca2+]i [17, 18]. Cả PMCA và kênh trao đổi
Na+/Ca2+ (NCX- Na+/Ca2+ Exchanger) đều vận chuyển Ca2+ ra khỏi tế bào.
Tuy nhiên, khác với NCX có ái lực thấp, dung lƣợng cao và loại bỏ một lƣợng
lớn Ca2+, thì chức năng PMCA hoạt động hiệu quả nhất khi mà [Ca2+]i rất
thấp vì vậy nó chủ yếu hoạt động để duy trì [Ca2+]i mức bình thƣờng (rất
thấp). Nồng độ Ca2+ tế bào chất đƣợc duy trì ở mức xấp xỉ 100nM bằng cách
thông qua PMCA và các chất vận chuyển Ca2+ ATPase (SERCA) trong lƣới
nội chất [21]. Ở động vật có vú, các đồng dạng ATPase khác nhau (PMCA1PMCA4) đƣợc mã hoá bởi ít nhất 4 gen riêng biệt (ATP2B1- ATP2B4). Trong
bốn đồng dạng của PMCA thì PMCA1 và PMCA4 phổ biến, trong khi
PMCA2 và PMCA3 đƣợc tìm thấy trong các tế bào dễ bị kích thích, ví dụ nhƣ
tế bào thần kinh, tai, tuyến vú, tuyến sữa và tế bào tim [61]. Trong các nghiên
cứu về biểu hiện PMCA, PMCA1 đã đƣợc phát hiện trong tất cả các mô và