BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, TÁC
DỤNG KHÁNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO CỦA
PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT CÂY BÁT GIÁC LIÊN
(Dysoma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H. Wang,
Berberidaceae)
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, TÁC
DỤNG KHÁNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO CỦA
PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT CÂY BÁT GIÁC LIÊN

trong quá trình làm việc và học tập.
Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, chồng và bạn bè
đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!
Hà Nội, ngày

tháng năm 2018

Học viên

DS. Nguyễn Thị Dung


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………….. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………………... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI PODOPHYLLUM…………………………………… 3
1.1.1. Về vị trí phân loại…………………………………………………………… 3
1.1.2. Về đặc điểm chung………………………………………………………….. 3
1.1.3. Về thành phần hóa học……………………………………………………… 4
1.1.4. Về tác dụng sinh học và độc tính……………………………………………

7

1.1.5. Về tác dụng, công dụng và một số bài thuốc trong YHCT…………………. 13
1.2. TỔNG QUAN CÂY BÁT GIÁC LIÊN………………………………………. 15
1.2.1. Về vị trí phân loại …………….…………………………………………….. 15
1.2.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố…………………………………………… 16

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC…………………………………………………... 32
3.1.1. Định tính bằng các phản ứng hóa học………………………………………

32


3.1.2. Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng……………………………...

34

3.2. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MẪU NGHIÊN
CỨU………………………………………………………………………………..

36

3.2.1. Chiết xuất……………………………………………………………………

36

3.2.2. Phân lập……………………………………………………………………... 37
3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập đƣợc………………………….

39

3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc……………………………… 44
3.3. TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN IN VITRO………………………... 54
3.3.1. Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH………………………………………….

54


Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ESI-MS

Phổ khối (Electrospray inoization mass spectrometry)

EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

1

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của proton

H-NMR

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

IC50


tr.

Trang

UV

Phổ tử ngoại (Ultra Violet Spectroscopy)

YHCT

Y học cổ truyền

δ

Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính là ppm)


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

STT

Bảng

Tên bảng

1

Bảng 1.1

Các chất phân lập đƣợc từ một số loài Podophyllum

liên bằng phản ứng hóa học
5

Bảng 3.2

Kết quả định tính cắn các phân đoạn của mẫu nghiên

33

cứu bằng các phản ứng hóa học
6

Bảng 3.3

Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR của BGL1 với dữ liệu

44

7

Bảng 3.4

Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR của BGL2 với dữ liệu

46

8

Bảng 3.5



Bảng 3.9

Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH các hợp chất phân lập

55

từ mẫu bát giác liên
13

Bảng 3.10

Hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd các phân đoạn từ

57

mẫu bát giác liên
14

Bảng 3.11

Hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd các hợp chất phân

58

lập từ mẫu bát giác liên
15

Bảng 3.12


Trang

diformis)
3

Hình 1.3

Cơ quan sinh sản của cây bát giác liên (Dysosma

17

diformis )
4

Hình 1.4

Một số thành phần hóa học có trong bát giác liên

18

5

Hình 2.1

Mẫu bát giác liên nghiên cứu

21

6


cứu
10

Hình 3.2

Sắc ký đồ định tính nhóm saponin trong mẫu nghiên

36

cứu
11

Hình 3.3

Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ và rễ bát giác

37

liên
12

Hình 3.4

Sơ đồ phân lập các chất từ cắn ethyl acetat thân rễ và rễ

39

bát giác liên
13



41

(1:1)
17

Hình 3.9

Sắc ký đồ chất BGL3 với hệ dung môi EtOAc :

41


CH3COOH : HCOOH : H2O (10:1:1:1)
18

Hình 3.10

Sắc ký đồ chất BGL4 với hệ dung môi MeOH : H2O

42

(3:1)
19

Hình 3.11

Sắc ký đồ chất BGL4 với hệ dung môi Toluen : ethyl

42


Hình 3.15

Cấu trúc của hợp chất BGL1

46

24

Hình 3.16

Cấu trúc của hợp chất BGL2

47

25

Hình 3.17

Cấu trúc của hợp chất BGL3

50

26

Hình 3.18

Cấu trúc của hợp chất BGL4

51


Hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd các phân đoạn từ

57

mẫu bát giác liên
31

Hình 3.22

Hoạt tính dọn gốc tự do superoxyd các hợp chất phân

58

lập từ mẫu bát giác liên
32

Hình 4.1

Tổng hợp các chất phân lập đƣợc

65


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây bát giác liên hay còn gọi là cây độc cƣớc liên, độc diệp nhất chi hoa, cƣớc
diệp, …, có tên khoa học là Dysosma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H.
Wang, tên đồng nghĩa là Podophyllum tonkinense Gagnepain, phân bố chủ yếu ở
một số tỉnh của Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam, …) và Việt Nam
(Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, ...) [11]. Ở Trung Quốc, cây bát giác liên đƣợc sử

nghiên cứu.
- Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng phƣơng pháp dọn gốc tự do DPPH,
superoxyd và tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thƣ trên mô hình in vitro của
bát giác liên và các chất phân lập đƣợc từ mẫu nghiên cứu.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI PODOPHYLLUM
1.1.1. Về vị trí phân loại
Chi Podophyllum thuộc họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), bộ Hoàng liên
(Ranunculales), lớp Ngọc lan (Magnoliosida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [1],
[3].
Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của chi Podophyllum
đƣợc thể hiện nhƣ sau [1], [3]:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliosida
Bộ Hoàng liên: Ranunculales
Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae
Chi: Podophyllum
Lưu ý: Theo Shaw, chi Dysosma đƣợc bao gồm trong chi Podophyllum [36].
Nên theo nhiều công bố gần đây, một số loài thuộc chi Podophyllum đƣợc sắp xếp
thuộc chi Dysosma.
1.1.2. Về đặc điểm chung
Cây thảo, sống lâu năm. Thân rễ bò, nhiều mấu, nhiều rễ con. Phần trên mặt
đất thẳng, có lá bắc lớn bao quanh gốc. Lá hình khiên, xẻ sâu hoặc chia 3-9 thùy.
Hoa mọc thành cụm hoặc chùm tán. Lá đài 6, thoái hóa. Cánh tràng 6, màu đỏ tía.
Cuống hoa rủ xuống, chiều dài nhƣ nhau. Bao phấn hƣớng trong, tự khai. Nhụy hoa

1.2, Hình 1.1). Trong đó, podophyllotoxin chiếm 20-40%, các α-peltatin và βpeltatin chiếm 5-10%. Ngoài ra, các lignan khác đƣợc phân lập bao gồm
demethylpodophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và podophyllotoxon, …, các chất
này tồn tại cả ở dạng tự do và dạng glycosid. Tỷ lệ thành phần của các lignan này
phụ thuộc vào loài và thay đổi theo mùa [39].
Một số flavonoid cũng đƣợc phân lập từ nhựa bao gồm astragalin,
isorhamnetin, kaempferol và quercetin [39].
Thành phần hóa học thứ hai – nhóm gồm những chất không tạo thành nhựa
bao gồm albumen, canxi oxalat, axit gallic, tinh bột, β-sitosterol, cả chất dễ bay hơi
và chất béo không bay hơi [39].
Tóm tắt các chất đã phân lập đƣợc từ một số loài Podophyllum đƣợc trình bày
trong bảng 1.1.

4


Bảng 1.1. Các chất phân lập đƣợc từ một số loài Podophyllum
Tên loài

Các chất đã phân lập đƣợc

Bộ phận

TLTK

dùng
P.

Rễ, thân rễ

hexandrum

peltatin, podophyllotoxon, 4’-demethylpodophyllotoxon, isopicropodophyllon, 4’demethylisopicropodophyllon.
P.

Rễ, thân rễ

pleianthum

Podophyllotoxin,

glucosid 4’-demethyl- [47],

podophyllotoxin, podophyllotoxin gluco- [80]
sid, 4’-demethylpodophyllotoxin, 4’-demethyldeoxypodophyllotoxin,

dehydro-

podophyllotoxin, diphyllin, podophyllotoxon, quercetin, kaempferol, các peltatin,
deoxypodophyllin, astragalin, hyperin, βsitosterol.
P. versipelle

Rễ

podophyllotoxin,
podophyllotoxin,
glucosid,

5

α-peltatin,


[24]

sikkimensis
Bảng 1.2. Hàm lƣợng các hợp chất lignan trong một số loài Podophyllum [74]
Chất (lignan)

Hàm lƣợng trong các loài Podophyllum
(mg/g khô, rễ và thân rễ)
P.

P.

P.

P.

hexandrum

peltatum

pleianthum

versipelle

Podophyllotoxin

42,7

2,5


0,03

_

β-peltatin

0,10

3,3

_

13,5

α-peltatin

0,07

2,5

_

1,2

Podophyllotoxon

0.57

0,20


0,05

_

6


Chất

R1

R2

R3

Podophyllotoxin

OH

H

CH3

4'-Demethylpodophyllotoxin

H

OH

H


OH

R3
Podophyllotoxon

CH3

4’-Demethylpodophyllotoxon

H

R3
Isopicropodophyllon

CH3

4’-Demethylisopicropodophyllon

H

Hình 1.1. Các hợp chất lignan trong một số loài Podophyllum
1.1.4. Về tác dụng sinh học và độc tính
1.1.4.1. Tác dụng sinh học

7


Theo các nghiên cứu đã công bố gần đây thì chi Dysosma nói riêng và chi
Podophyllum nói chung có nhiều tác dụng sinh học đã đƣợc chứng minh nhƣ sau:

Nghiên cứu trên in vitro của Showkat Ahmad và cộng sự (2013) đã cho thấy
cao chiết n-hexan của Podophyllum hexandrum có khả năng thu dọn tốt đối với các
gốc tự do DPPH, O2•, OH• và H2O2. Mức độ ảnh hƣởng của cao chiết n-hexan của
Podophyllum hexandrum tƣơng đƣơng với tác dụng chống oxy hóa của vitamin E
[73].
Theo một nghiên cứu khác: Cao chiết ethanol từ thân rễ và rễ của
Podophyllum hexandrum (4 mg/ml) cho thấy tác dụng ức chế enzym
acetylcholinesterase trên in vitro và có hoạt tính chống oxy hoá mạnh (IC50 = 21,56
μg/ml) [57].
Nghiên cứu của Mengfei Li cùng cộng sự (2012) cho thấy cao chiết từ rễ
Podophyllum hexandrum có khả năng chống oxy hoá tốt hơn cao chiết từ các bộ
phận khác trong các thử nghiệm DPPH và thử nghiệm năng lƣợng chống oxy
hóa sắt thấp. Các thành phần nhƣ axid phthalic, ester diisobutyl ester, 1,2benzendicarboxylic acid, ester diisooctyl, polyneuridin, deoxypodophyllotoxin, βsitosterol và podophyllotoxin có khả năng chống oxy hoá ở một mức độ nhất định.
deoxypodophyllotoxin, podophyllotoxin và polyneuridin có khả năng chống oxy
hoá mạnh hơn với các giá trị IC50 ở thử nghiệm DPPH và thử nghiệm năng
lƣợng chống oxy hóa sắt thấp tƣơng ứng là 9,61 ± 0,81 và 2923,98 ± 21,89 μM;
9,98 ± 0,24 và 2847,27 ± 14,82 μM; 13,37 ± 0,35 và 2404,32 ± 36,88 μM so với
chất đối chứng acid ascorbic với các giá trị là 60,78 ± 1,22 và 1267,5 ± 30,24 μM (
p< 0,01) [59].
Tác dụng kháng virus
Việc điều tra hoạt tính kháng virus của các lignan phân lập từ các loài
Podophyllum bắt đầu bằng việc sử dụng một cao chiết ethanol chống lại chứng
chuột bạch (một loại bệnh do papillomavirus gây ra) [54]. Một số cơ chế hoạt động
kháng virus của lignan đã đƣợc đề xuất. Bedows và Hatfield đã chỉ ra rằng
podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và β-peltatin có hoạt tính chống lại virus
sởi và virus Herpes simplex I. Họ đề xuất rằng hoạt tính này có thể là do sự phá vỡ
các tế bào vi khuẩn gây cản trở sự nhân lên của virus [23].

9


thanh, và làm tăng đáng kể glutathion, glutathion peroxidase, glutathion reductase,
superoxid dismutase và glutathion-S-transferase ở các mức khác nhau, phụ thuộc
vào liều [47].
Theo một nghiên cứu khác: nhóm chất flavonoid (quercetin và kaempferol)
trong loài Podophyllum versipellis đã đƣợc chứng minh có tác dụng bảo vệ gan do
độc tố podophyllotoxin gây ra. Trên chuột thí nghiệm, nhóm sử dụng cả
podophyllotoxin và flavonoid có tỷ lệ tử vong và tổn thƣơng gan, thận thấp hơn
đáng kể so với nhóm chỉ dùng podophyllotoxin. Các tác dụng biểu hiện trên lâm
sàng gồm giảm nồng độ transaminase huyết tƣơng, phosphatase kiềm, lactat
dehydrogenase, ure huyết tƣơng, creatinin và tăng nồng độ glutathion [41], [55].
Các tác dụng khác

10


Thân rễ và rễ của các loài Podophyllum hexandrum và Podophyllum peltatum
có chứa một hỗn hợp nhựa gọi là podophyllin. Năm 1820, nhựa này đƣợc liệt kê
trong Dƣợc điển Hoa Kỳ nhƣ một thuốc tẩy [58], nhƣng việc sử dụng nó đã giảm do
có độc tính cao [25]. Tuy nhiên, tình hình đã thay đổi kể từ khi Kaplan (1942) đƣa
ra một chế phẩm có chứa dịch chiết ethanol của podophyllin trong dầu khoáng để
điều trị bệnh hoa liễu [46]. Từ sự kiện này, đã có một mối quan tâm mới trong
nghiên cứu nhựa, tìm kiếm các ứng dụng mới từ chất này và cũng đã mang lại
những kết quả đáng kể trong việc điều trị ung thƣ da [39]. Trong một nghiên cứu về
hiệu quả của các lignan đƣợc phân lập từ một số loài của chi Podophyllum đối với
tế bào ung thƣ da utaneous cytodestructive, kết quả chỉ ra rằng podophyllotoxin có
tiềm năng mạnh nhất, tiếp theo là các peltatin và 4'-demethylpodophyllotoxin [39].
Trong việc tìm kiếm các hợp chất trừ sâu mới từ thực vật, Miyazawa và cộng
sự đã chỉ ra hoạt tính diệt côn trùng tốt của podophyllotoxin và
acetylpodophyllotoxin đƣợc phân lập từ cao chiết dichloromethan của thân rễ P.
hexandrum (thử trên loài côn trùng Drosophila melanogaster) [69]. Trong một

Một nghiên cứu về khả năng gây ung thƣ da của các lignan đƣợc phân lập từ
một số loài của chi Podophyllum, đƣợc đánh giá bằng cách làm thay đổi độ dày da
thỏ, chỉ ra rằng podophyllotoxin có hiệu lực gấp hai lần của α-peltatin và cả hai có
hiệu lực cao hơn 4'-demethylpodophyllotoxin và β-peltatin - chất có hoạt tính nhiều
hơn không đáng kể so với các chất đối chiếu. Nếu chỉ số kích ứng thị giác đƣợc sử
dụng làm chỉ số để đánh giá hồng ban thì trình tự hiệu lực vẫn nhƣ trên nhƣng tất cả
bốn lignan cho thấy hoạt tính nhiều hơn so với chất đối chiếu [39].
Philips và cộng sự (1948) đã nghiên cứu độc tính của podophyllotoxin trên
một số loài động vật và đã đƣa ra đƣợc giá trị LD50 theo các đƣờng đƣa thuốc khác
nhau. LD50 theo đƣờng tiêm tĩnh mạch: chuột cống là 8,7 mg/kg, mèo là 1,7 mg/kg,
thỏ là 5 mg/kg. LD50 theo đƣờng tiêm dƣới màng bụng: chuột nhắt là 33 mg / kg,
chuột cống là 15 mg/kg. LD50 theo đƣờng tiêm bắp: mèo là 4 mg/kg, chuột cống là
3 mg/kg. Động vật nhận liều gây chết trong vòng 24 giờ, quan sát thấy có xuất hiện
kích thích hô hấp, với chó đôi khi hiển thị nhịp tim chậm. Giai đoạn cuối có liên
quan tới huyết áp tụt và suy hô hấp. Ở mèo và chuột cống, các liều gây tử vong
cũng dẫn đến tổn thƣơng phổi nghiêm trọng. Các triệu chứng độc hại khác bao gồm
tổn thƣơng đƣờng tiêu hóa, gan, thận và rối loạn huyết khối. Ngoài ra, ở liều độc
còn làm tăng tiểu cầu, tuy nhiên dấu hiệu này sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng sau khi
loại bỏ liều độc [67].

12


Về độc tính trên ngƣời, Dudley (1980) đã báo cáo cái chết của một phụ nữ lớn
tuổi sau khi ăn khoảng 300mg nhựa podophyllin và Petersen cùng cộng sự cũng đã
mô tả một trƣờng hợp tƣơng tự sau khi nuốt phải 350mg. Ở cả hai trƣờng hợp trên,
các triệu chứng độc hại bao gồm lơ mơ, tăng huyết áp và hôn mê. Việc nuốt tình cờ
khoảng 4 g podophyllum trong dung dịch benzoin đã đƣợc báo cáo là dẫn đến hạ
huyết áp, thiếu ngủ và hạ kali máu kèm theo do rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng
nghiêm trọng và loét đƣờng tiêu hoá. Sau khi đƣợc điều trị tích cực, bệnh nhân hồi

sử dụng cho mục đích y học để điều trị vết loét, tiêu chảy, rối loạn gan, bệnh lao
[70] và các rối loạn phụ khoa [25]. Quả chín đƣợc ăn ở một số vùng của dãy
Himalaya, Ấn Độ để thúc đẩy sự thụ thai [45].
Với nền y học cổ truyền của ngƣời da đỏ Maine Penobscot, nhựa của cây
Podophyllum peltatum đã đƣợc sử dụng để điều trị rắn độc cắn, ung thƣ và rễ của
cây này đã đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân tự tử và chất độc [49]. Với những ngƣời
Cherokee Ấn Độ, thân rễ và toàn bộ cây P. peltatum đã đƣợc sử dụng nhƣ một chất
tẩy rửa chậm và nhƣ một thuốc chống giun sán [34]. Ngƣời Mỹ bản địa thì sử dụng
để điều trị một số bệnh da và khối u với dịch chiết từ rễ cây này [75].
Podophyllum pleianthum là một trong những loại thảo mộc truyền thống cổ
nhất Trung Quốc. Các chế phẩm dùng thân rễ trong nƣớc hoặc rƣợu của loài này đã
đƣợc sử dụng ở Đài Loan và Trung Quốc [47]. Trong y học cổ truyền Trung Quốc,
một số mục đích sử dụng chủ yếu của P. pleianthum bao gồm điều trị rắn cắn, hạch
to, khối u và các rối loạn khác [47], [71]. Do các tác dụng phụ độc hại, việc sử dụng
lâm sàng của loại cây này nhƣ là một loại thuốc chống ung thƣ đã bị giới hạn. Tuy
nhiên, các chuyên gia chăm sóc sức khoẻ vẫn sử dụng P. pleianthum ở Đài Loan để
phục hồi từ tình trạng sau sinh, đau đầu mạn tính, u xơ gan, đau thắt lƣng và các
chứng bệnh khác [47].
Tóm tắt kết quả nghiên cứu về công dụng của một số loài Podophyllum đƣợc
thể hiện qua bảng 1.3.
Bảng 1.3. Công dụng của một số loài Podophyllum
Công dụng

Tên loài

TLTK

P. pleianthum Ức chế khối u, chống ung thƣ, điều trị rắn cắn, hạch to, [47],
khối u, đau đầu mạn tính, u xơ gan, đau thắt lƣng.


Bài 2: Chữa bệnh tràng nhạc.
50 đến 100 gam bát giác liên, 100 gam rƣợu gạo, thêm nƣớc vào sắc [41].
Hoặc: Rễ bát giác liên nghiền thành bột, điều chế với giấm, đắp vào hạch
sƣng đau. Hoặc dùng 30 gam thân rễ, sắc nƣớc uống, còn bã đắp tại chỗ [11].
Bài 3: Chữa rắn cắn.
Rƣợu ngâm thân củ bôi lên vùng tổn thƣơng, cũng có thể dùng bằng đƣờng
uống, 10 gam mỗi lần [27]. Hoặc: 6-12 gam thân rễ bát giác liên giã nát, lấy
nƣớc uống, bã đắp [3].
1.2. TỔNG QUAN CÂY BÁT GIÁC LIÊN
1.2.1. Về vị trí phân loại
Cây bát giác liên hay còn gọi là độc cƣớc liên, cƣớc diệp, pha mỏ (Tày), quỷ
cữu [11] có tên khoa học là ; Dysosma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H.
Wang ex T. S. Ying (tên đồng nghĩa là Dysosma tonkinensis (Gagnepain) Hiroe;

15


Podophyllum

difforme Hemsley

tonkinense Gagnepain; Podophyllum

&

E.

H.

Wilson;

5. Lá, 6. Mép lá

16