BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG HÙNG MẠNH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
BACOSIDE A3 TRONG DƯỢC LIỆU
RAU ĐẮNG BIỂN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG HÙNG MẠNH
Mã sinh viên: 1301272

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
BACOSID A3 TRONG DƯỢC LIỆU
RAU ĐẮNG BIỂN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
2. TS. Trần Nguyên Hà
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
2. Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI – 2018

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về loài Bacopa monnieri ........................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri ................................... 2
1.1.2. Bộ phận sử dụng ........................................................................................................ 2
1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................................. 2
1.1.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................................... 5
1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC ............................................................................ 7
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động ................................................................................................ 7
1.2.2. Cấu tạo HPLC ........................................................................................................... 8
1.3. Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3 ........... 10
1.3.1. Phương pháp chiết xuất .......................................................................................... 10
1.3.2. Phương pháp phân tích định lượng ....................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 15
2.1. Đối tượng và hóa chất, thiết bị ................................................................................. 15
2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................. 15
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất .............................................................................................. 15
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 16
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích .......................................................................... 16
2.2.2. Thẩm định phương pháp......................................................................................... 16
2.2.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................ 16
2.2.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................ 16
2.2.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................................ 17
2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................. 17


2.2.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 18
2.2.2.6. Độ đúng ................................................................................................................. 18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 20

analytical chemists)

ACN

Acetonitrile

BA3

Bacosid A3

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

MeOH

Methanol

PDA

Detector mảng diod

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Realtive Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
1.1

Nội dung
Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

Trang
4

jujubogenin trong rau đắng biển
1.2

Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

4

pseudojujubogenin trong rau đắng biển
1.3

Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển

5

1.4

Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo

10



3.6

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp

31

3.7

Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp

32

3.8

Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu dược liệu rau đắng biển

33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Nội dung

Hình

Trang

1.1

Rau đắng biển – Bacopa monnieri


Quy trình chiết Bacosid A3 trong rau đắng biển

23

3.5

Sắc ký đồ (a) Bacopasid I; (b) Bacosid A3 chuẩn và (c) mẫu thử với

24

hệ pha động ACN và đệm phosphat (pH = 2,3) theo chương trình
dung môi 1
3.6

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động

25

ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (35:65)
3.7

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động

26

ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68)
3.8

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn; (b) mẫu thử và (c) mẫu thử thêm

và Bacopasaponin C. Trong đó, Bacosid A3 là một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối
lớn (chiếm 0,14-0,85% (kl/kl) ở loài B.monnieri tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ, đồng
thời chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A.
Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng Bacosid trong rau đắng biển còn
chưa được tiêu chuẩn hóa. Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam IV chưa đề cập đến dược
liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này. Do đó, việc xây
dựng phương pháp xác định hàm lượng các Bacosid trong rau đắng biển là rất cần thiết.
Theo Dược điển Mỹ (USP 38) và Dược điển Ấn Độ (IP 2010), chất chuẩn Bacosid
A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại Bacosid
chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong rau đắng biển. Trong khuôn khổ khóa luận này, do
bị giới hạn về thời gian, kinh tế nên chúng tôi chỉ có thể định lượng hàm lượng một thành
phần Bacosid A3, bước đầu làm cơ sở để định lượng 4 Bacosid còn lại. Vì vậy, đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng Bacosid A3 trong dược liệu rau đắng biển (Bacopa
monnieri)” được thực hiện với mục tiêu:


Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển

bằng phương pháp HPLC.


Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Bacosid A3 trong một

số mẫu rau đắng biển thu hái ở Việt Nam.
1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.



2


a. Saponin triterpenoid
Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B. monnieri chính là các saponin có
cấu trúc nhân dammaran với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin (Bảng 1.1 và
1.2).
Nghiên cứu về thành phần hóa học đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của
2 saponin là Bacosid A và Bacosid B [9], [12]. Sau đó, các thành phần hóa học chính có
tác dụng cải thiện trí nhớ của B.monnieri đã được phân lập và xác định công thức. Các
thành phần đó là Bacosid A và Bacosid B được phân lập đồng thời cùng nhau, chỉ khác
nhau ở độ quay cực [11].
Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng Bacosid A và Bacosid B không
hoàn toàn là đơn chất mà là hỗn hợp của các saponin [21]. Trong đó, Bacosid A cũng là
thành phần hóa học trong rau đắng biển được nghiên cứu nhiểu nhất. Hàm lượng Bacosid
A trong các bộ phận của rau đắng biển là khác nhau với hàm lượng cao nhất ở thân (9,54
mg/g) và thấp nhất ở hoa (1,91 mg/g) [27]. Tuy nhiên, các thông tin cụ thể về hoạt tính
sinh học của từng Bacosid vẫn chưa được làm rõ [22]. Bacosid A là hỗn hợp của 4
triglycosidic saponin: Bacosid A3, Bacopasid X (jujubogenin), Bacopasid II và
Bacosaponin C (pseudojujubogenin) với khoảng hàm lượng lần lượt là 0,14-0,85%; 0,050,72%; 0,12-0,69% và 0,05-0,44% (kl/kl) khi thu hái tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ [8],
[13]. Trong đó, Bacosid A3 có công thức phân tử là: C47H76O18, khối lượng mol: 929,11
g/mol, là một chất bột trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy từ 244-250oC, có tính
phân cực mạnh và hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như: MeOH, EtOH [39].
Bacosid B là một hỗn hợp các aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như:
bacopasid

N1,

bacopasid

Bacosid A3

R
β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-{α-L-arabinofuranosyl(1→2)}-O-(β-D- glucopyranosyl)

2

Bacopasid N1

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

3

Bacopasid IV

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl

4

Bacopasid X

α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl-

(Bacopasaponin C

(1→3)}- α-L-arabinofuranosyl

isomer)
Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là
pseudojujubogenin trong rau đắng biển [46]

4


b. Flavonoid
Ngoài các saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, Flavonoid được tìm thấy
trong rau đắng biển là Luteonin và Apigenin (Bảng 1.3). Một số nhà khoa học đã tiến
hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau của rau đắng biển được thu hái tại
các vùng khác nhau tại Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu
được kết quả hàm lượng Luteolin trong lá B.monnieri thu hái tại vùng Bhayander,
Maharashtra là 0,1691 ± 0,0024 mg/ 500 g; trong khi hàm lượng Luteolin định lượng
trong thân B.monnieri thu hái tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500 g
[45]. Ngoài ra, hàm lượng Luteolin và Apigenin được định lượng trong dịch chiết MeOH
của B.monnieri lần lượt là 0,22% và 0,45% [31].

Luteolin

Apigenin

Bảng 1.3: Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển
c. Các thành phần khác:
Ngoài ra, rau đắng biển còn chứa các alkaloid như Hydrocotylin, Brahmin,
Herpestin và các glycosid như Asiaticosid, Thanakunicid [32], [37].
1.1.4. Tác dụng dược lý
a. Theo y học cổ truyền:
Rau đắng biển có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh
nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng. Toàn cây rau đắng biển được dùng chữa
suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, thao cuồng, mất tiếng, khản tiếng,
viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí đái, viêm gan, thấp khớp, rắn cắn và bệnh ngoài da
như da sưng dày lên như da voi, lở, nhọt độc, ghẻ. Ngày 6-12 g dạng thuốc sắc, dùng
ngoài không kể liều lượng. Ngoài ra, rau đắng biển có thể được dùng như rau sống hoặc

0,5 mg/ kg có tác dụng hạ huyết áp ở mèo, với liều nhỏ hơn gây tăng huyết áp nhẹ do co
mạch và kích thích cơ tim. Tổng các thành phần chiết xuất từ B.monnieri có tác dụng trợ
tim, co mạch, ức chế hệ thần kinh – cơ [23].


Tác dụng trên hệ thần kinh:
+ Tác dụng chống lo âu, trầm cảm: Các thành phần bacosid A và B, bacosid I,

bacosid II, và bacopasaponin C đã được chứng minh là có hoạt tính chống trầm cảm trên
mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình treo đuôi chuột trong nghiên cứu của Zhon và
cộng sự năm 2007 [46]. Ngoài ra, Hersaponin - một loại glycosid được phân lập từ
B.monnieri, đã được chứng minh là có tác dụng an thần, chống lo âu [23].
+ Tác dụng chống động kinh: Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi
Dhanasekaran và cộng sự năm 2007 cho kết quả về hiệu quả của dịch chiết B.monnieri
trong việc làm giảm các triệu chứng của động kinh [14]. Một thí nghiệm khác nghiên cứu
6


về động kinh thùy thái dương (một hội chứng động kinh thường gặp) cho thấy hiệu quả
điều trị của B.monnieri và Bacosid A trên chuột bị động kinh [24].
+ Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: B.monnieri có tác
dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá
trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não [44]. Nghiên cứu việc sử
dụng sản phẩm từ B.monnieri trong điều trị rối loạn khả năng tập trung ở trẻ em (ADHD –
Attention-deficit hyperactivity disorder) được tiến hành kiểm soát ở đại học Y dược BRD
tại Gorakhpur, kết quả thu được cho thấy sự gia tăng đáng kể trong việc nhắc lại câu văn,
tư duy logic và học tập theo cặp trong cả 19 trẻ được sử dụng Bacopa [38].


Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết cồn của lá B.monnieri tăng nồng độ hormone

7


chất phân tích sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau dẫn đến sự phân tách. Thành phần pha
động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất
phân tích với thời gian hợp lý. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và
chuyển qua bộ phận xử lí số liệu [1], [5], [18].
1.2.2. Cấu tạo HPLC
Nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận
kết nối với nhau [1], [2], [5], [18]:


Hệ thống cấp pha động;



Bơm sắc ký lỏng;



Bộ phận tiêm mẫu;



Cột;



Detector;



được đặt trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc
ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi).

8


1.2.2.3.

Bộ phận tiêm mẫu

Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều
chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 µL – 100
µL. Có 2 cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu tự động. Khi tiêm
bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ.
1.2.2.4.

Cột

Một máy HPLC bình thường có hai cột: cột phân tích và cột bảo vệ.


Cột phân tích:
-

Loại cột phân tích phổ biến nhất hiện nay được làm bằng thép không gỉ;

ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.
-



Detector quang phổ: Detector được sử dụng phổ biến nhất, hoạt động dựa trên sự

đo lường quang phổ, bao gồm sự hấp thụ UV-VIS và sự phát huỳnh quang. Cấu tạo của
Detector loại này gồm: nguồn sáng, bộ lọc ánh sáng, cách tử, buồng đo, mảng Diod.
-

Detector hấp thụ UV-VIS: áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh

sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến. Khi dùng detector này quang phổ thu được là đồ
thị của độ hấp thụ biến thiên theo thời gian rửa giải. Giới hạn phát hiện từ 100pg – 1ng
chất phân tích. Thiết bị có sử dụng thêm mảng diod trong quá trình đo phổ có thể ghi lại
9


toàn bộ phổ, sắc ký đồ 3 chiều biểu thị độ hấp thụ là một hàm theo bước sóng và thời gian
rửa giải.
Detector huỳnh quang (RF): sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát

-

huỳnh quang (tính chọn lọc). Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang,
cần tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang.


Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất đường.



Detector điện hóa: Detector hoạt động dựa trên nguyên tắc đo điện thế, độ dẫn,

+ Dung môi sử dụng: MeOH.

[29]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và phơi khô.
+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%.

[30]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và ép loại bỏ
nước, phơi khô.
+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%, MeOH.
10


[41]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột, rây qua rây 355.
+ Dung môi sử dụng: MeOH 70%.

[43]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột mịn.
+ Dung môi sử dụng: MeOH.

Nhận xét: Các phương pháp chiết được sử dụng để chiết Bacosid trong rau đắng biển là
chiết ngâm, chiết hồi lưu, chiết Soxhlet hay chiết bằng sóng siêu âm. Các dung môi sử
dụng chiết Bacosid trong các tài liệu tham khảo chủ yếu là MeOH và EtOH. Ngoài ra, các
nghiên cứu [24], [26] trong quá trình chiết có sử dụng thêm n-Butanol, Aceton hoặc
Hexan để loại bỏ chất béo và tạp.


-

Kết quả:
+ Hai thành phần có hàm lượng lớn nhất trong rau đắng biển là Bacopasid II (0,27 –
0,59%, kl/kl) và Bacopasid I (0,35 – 0,71%, kl/kl).
+ Hàm lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển là 0,07-0,34% (kl/kl).

 Theo Sivaramakrishna C. và cộng sự [39]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt)
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: 30oC
+ Thể tích tiêm: 20µL
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm

-

Kết quả: Bacosid A3 chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A.

 Dược điển Anh (BP 2016) đưa ra điều kiện [41]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 :
685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric


30

25

60

40

35

40

60

36

70

30

45

70

30

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm

13


+ Bacosid A3 chiếm hàm lượng tương đối lớn (29,45%, kl/kl) trong 4 thành phần
của Bacosid A.
+ Các tài liệu tham khảo chỉ công bố thời gian lưu của các Bacosid khác so với
BA3 cho thấy có thể sử dụng BA3 làm căn cứ để xác định các thành phần khác trong
dược liệu rau đắng biển.

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng và hóa chất, thiết bị

2.1.1. Đối tượng
Các mẫu dược liệu rau đắng biển (Bacopa monnieri) sử dụng trong nghiên cứu
được thu hái và phơi khô tại “Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung bộ - Viện dược
liệu”. Các mẫu này đều được giám định tên khoa học tại khoa tài nguyên của Viện Dược
Liệu lưu giữ tại khoa Công Nghệ Chiết Xuất – Viện Dược Liệu
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất


Chất chuẩn:
+ Bacosid A3 Trung Quốc (98%).
+ Bacopasid I Trung Quốc.




Máy HPLC UFLC Shimadzu, Nhật Bản.



Các dụng cụ khác: Bình định mức, Micropipet 100-1000 µl, ống đong, cồn kế, …

15


2.2.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích
Dựa trên các tài liệu tham khảo về điều kiện chiết Bacosid trong rau đắng biển
(Bảng 1.4), chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chiết mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký
để xây dựng phương pháp phân tích.
Khảo sát điều kiện chiết mẫu:


Dung môi chiết: Khảo sát các dung môi: MeOH, EtOH 96o, EtOH 50o, nước. Lựa

chọn dung môi và nồng độ tại đó cho hiệu suất chiết cao nhất.


Thời gian chiết: Chiết mẫu với các thời gian khác nhau. Lựa chọn thời gian chiết

tại đó Bacosid A3 được chiết kiệt và tiết kiệm thời gian nhất.
Lựa chọn điều kiện sắc ký:


Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các chất tương
tự, tạp chất,… Trong phép phân tích định lượng, đó là khả năng xác định chính xác chất
phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả
chính xác. Sau khi chuẩn bị mẫu thử, phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được peak sắc

16


ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. Đánh giá tính đặc hiệu
bằng cách tiến hành so sánh sắc ký đồ của hai mẫu: Mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.
Yêu cầu: Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải tương đồng nhau,
trong đó peak của Bacosid A3 phải tương tự nhau về thời gian lưu và chỉ khác nhau về
diện tích peak. Đồng thời, phổ tại các điểm trên peak của Bacosid A3 thuộc hai sắc ký đồ
phải giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại.
2.2.2.3.

Đường chuẩn

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn Bacosid A3 pha trong MeOH: 25, 50, 100, 200,
250, 500 µg/ml, từ chuẩn Bacosid A3 1 mg/ml. Tiến hành đo các mẫu dung dịch chuẩn đã
chuẩn bị. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ
(trục hoành x). Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính (y = ax + b) bằng Microsoft
office Excel.
Yêu cầu: Hệ số tương quan R: 0,995 ≤ R ≤ 1.
Độ chệch giữa các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn ∆ i =

Ct−Cc
Cc