BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỈ LỆ
THÀNH CÔNG TRONG VI GHÉP CÁC GIỐNG BƯỞI
(Citrus grandis O.)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NHƯ THẢO

Tháng 9/2008

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỈ LỆ THÀNH
CÔNG TRONG VI GHÉP CÁC GIỐNG BƯỞI
( Citrus grandis Ocbeck )


đầu dòng - VNCCAQMN).
 Các anh chị lớp DH01, DH02, các bạn lớp DH04SH đã hết lòng giúp đỡ và
chia sẽ cùng tôi những khó khăn, vui, buồn trong thời gian qua.

Sinh viên thực hiện
LÊ THỊ NHƯ THẢO

iii


TÓM TẮT
Đề tài “ Nghiên Cứu Các Yếu tố Ảnh Hưởng Đến Tỉ Lệ Thành Công
Trong Vi Ghép Cây Bưởi (Citrus)” được tiến hành tại Viện Nghiên Cứu Cây Ăn
Quả Miền Nam, thời gian tiến hành từ ngày 1/4 đến ngày 20/9/2008.
Giáo viên hướng dẫn:
Thạc sĩ.NGUYỄN THANH BÌNH
Hiện nay ngành trồng cây có múi ở Việt Nam đang phát triển mạnh, song
vẫn gặp nhiều khó khăn do sự phát triển ngày càng đa dạng và phức tạp của dịch
bệnh, đặc biệt là bệnh Vàng Lá Greening và Tristeza. Cho nên việc sạch hóa nguồn
giống tạo cây sạch bệnh và cải tạo giống mới có khả năng chống chịu với dịch bệnh
là nhiệm vụ hết sức cấp bách trong công tác sản xuất cải tạo giống. Đề tài được thực
hiện trên các giống bưởi thương phẩm khác nhau như: dùng làm gốc ghép (bưởi:
Đường Lá Cam, Da Xanh, Lông Cổ Cò; Cam Mật, Rough Lemon), dùng làm chồi
ghép các giống bưởi (Đường Lá Cam, Da Xanh, Lông Cổ Cò).
Kết quả thu được:
 Thí ngiệm 1: Chất khử trùng tốt nhất sử dụng trong vi ghép là: Calcium
HypoChloric trong 10 phút ( 100%).
 Thí nghiệm 2:
Gốc ghép Rough Lemon và bưởi Da Xanh có tỉ lệ tiếp hợp cao nhất với chồi
Đường Lá Cam (88,9%), trong khi bưởi Da Xanh lại thích hợp với gốc ghép Cam

 Test 2:
Rough Lemon or Da Xanh are the best conjugation for pomelo Duong La
Cam (88.9%), pomelo Da Xanh is appsitely with Cam Mat (55.6%), and foot-graft
pomelo Long Co Co is appsitely with Duong La Cam (33.33%)
However, Rough Lemon foot-graft is the best conjugation with all race.
 Test 3:
Pomelo Duong La Cam (55.55%) is appsitely with BA 0.1 mg/l, with strength
BA 0.5 mg/l is good for development of pomelo Da Xanh (66.67%), and
pomelo Duong La Cam(33.33%) is appsitely with BA 1 mg/l.
However, strength BA 0.1 mg/l is good for all race.

v


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ..................................................................................................................... i
Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii
Tóm tắt....................................................................................................................... iv
Summary......................................................................................................................v
Mục lục ...................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ ix
Danh sách các hình, sơ đồ ...........................................................................................x
Danh sách các bảng .................................................................................................. xii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..............................................................................................................1
1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài..............................................................2
1.2.1 Ý nghĩa khoa học................................................................................................2
1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................................2
1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài..............................................................................2

2.4.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật ...........................................................27
2.5 Các kỹ thuật cơ bản để loại trừ virus trong nhân giống ......................................28
2.6 Kỹ thuật vi ghép ..................................................................................................28
2.6.1 Nghiên cứu trong nước.....................................................................................29
2.6.2 Nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................30
2.6.3 Các yếu tố ảnh hưởg đến kỹ thuật vi ghép .......................................................32
2.6.4 Quy trình kỹ thuật vi ghép................................................................................32
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................34
3.1 Vật Liệu ..............................................................................................................34
3.1.1 Dụng cụ và trang thiết bị ..................................................................................34
3.1.1.1 Dụng cụ..........................................................................................................34
3.1.1.2 Trang thiết bị .................................................................................................34
3.1.3 Môi trường nuôi cấy .........................................................................................34
3.1.2 Mẫu cấy ............................................................................................................34
3.2 Điều kiện nuôi cấy...............................................................................................35
3.3 Phương pháp vi ghép ...........................................................................................36
3.4 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................37
3.4.1 Bố trí thí nghiệm...............................................................................................37

vii


3.4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chất khử trùng ..............................................37
3.4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của gốc ghép đến lệ vi ghép ..............................39
3.4.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP .............................................................41
3.4.2 Quy trình thí nghiệm ........................................................................................42
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................44
4.1 Ảnh hưởng chất khử trùng lên khả năng sống và tiếp hợp của chồi vi
ghép các giống bưởi...................................................................................................44
4.2 Ảnh hưởng cảu gốc ghép đến tỉ lệ tiếp hợp và phát triển của chồi ghép ............46

Le

:

Rough Lemon

CM

:

Cam Mật

VLG

:

Bệnh Vàng Lá Greening

RCC

:

Rầy chổng cánh

CCM

:

Cây có múi


Hình 2.17: Triệu chứng bệnh phấn trắng do nấm Oidium sp. ...................................16
Hình 2.18: Triệu chứng xì mủ thân do nấm Phytophthora spp ....................................16
Hình 2.19: Bệnh mốc hồng........................................................................................16
Hình 2.20: Bệnh Mốc xanh trên trái..........................................................................17
Hình 2.21: Hạt bưởi nảy mầm ...................................................................................19
Hình 2.22: Thân cây hai lá mầm ...............................................................................21
Hình 2.23: Cách ghép áp ...........................................................................................22
Hình 2.24: Cách ghép cành .......................................................................................23

x


Hình 2.25: Chồi nách trên thân cây ...........................................................................23
Hình 2.26: Cách ghép cửa sổ.....................................................................................24
Hình 2.27: Cách ghép chữ T......................................................................................24
Hình 2.28: Cách ghép mắt dạng mảnh ......................................................................25
Hình 2.29: Minh họa quá trình vi ghép .....................................................................33
Hình 3.1: Cấu trúc chồi đỉnh .....................................................................................37
Hình 3.2: Minh họa quá trình vi ghép .......................................................................35
Hình 4.1: LCC ghép trên gốc Le 2 tháng tuổi ...........................................................46
Hình 4.2: ĐLC trên gốc ghép DX .............................................................................47
Hình 4.3: ĐLC trên gốc ghép Le 30 ngày tuổi ..........................................................47
Hình 4.4: DX trên gốc ghép CM 30 ngày tuổi ..........................................................57
Sơ đồ quy trình vi ghép .............................................................................................32

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

trong đó diện tích trồng cây có múi là 81.690 ha. Diện tích cây có múi ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long chiếm 56,3% tức 45.970 ha dẫn đầu cả nước. Với thế mạnh là các
giống bưởi thương phẩm: Da Xanh, Long Cổ Cò, Đường Lá Cam, Năm Roi .v.v.
ngành bưởi Việt Nam đang mở rộng thị trường tiêu thụ cả trong và ngoài nước.
Tuy nhiên tình hình phát triển cây có múi lại gặp không ít khó khăn do dịch bọ
xít, rầy, rệp, sâu hay các bệnh virus gây ra, đặc biệt là bệnh vàng lá Greening gây
thiệt hại rất nghiêm trọng. Bên cạnh đó là công tác quản lý các nguồn giống chưa
thực hiện tốt, một số cây giống được tách chiết từ những cây mang mầm bệnh đã
làm tăng khả năng lan truyền của bệnh.
Nhằm ngăn chặn hiểm hoạ dịch bệnh trên cây có múi, từ năm 1996 đến nay
Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam đã tiến hành nghiên cứu phương pháp vi
ghép đỉnh sinh trưởng cây có múi. Tuy tỷ lệ thành công vẫn còn hạn chế nhưng đây
là nền tảng để mở ra các hướng nghiên cứu khác giúp hoàn thiện và nâng cao tỷ lệ
thành công trong vi ghép, đặc biệt là các giống bưởi với tỉ lệ vi ghép thành công còn
rất thấp.
Được sự hỗ trợ của Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam chúng tôi thực hiện
đề tài “ NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỈ LỆ THÀNH
CÔNG TRONG VI GHÉP CÁC GIỐNG BƯỞI (Citrus)“ đề tài có tính cấp thiết
phục vụ cho công tác sạch hóa, cải tạo giống, áp dụng vào việc sản xuất cây giống
bưởi sạch bệnh trong nhân giống phục vụ nhà vườn, bổ sung hoàn thiện phương
pháp vi ghép.
1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

xiii


1.2.1 Ý nghĩa khoa học
-

Bổ sung hoàn thiện phương pháp nghiên cứu và ứng dụng kết quả của các qui


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây bưởi
2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm thực vật học cây bưởi
2.1.1.1 Nguồn gốc
Theo nghiên cứu của Alphone De Candle (1886) cây bưởi có nguồn gốc lâu
đời tại quần đảo Malaysia.
1983 với suy luận của mình Roxburgh đã cho rằng bưởi được di thực từ đảo
Java (Indonesia) đến Calcutta (Ấn Độ). Tuy nhiên 1967 Webber cùng cộng tác viên
đã cho rằng Malaysia và Indonesia là nơi khởi phát của cây bưởi, bắt nguồn từ hai
nước này bưởi đã truyền giống sang Trung Quốc, Ấn Độ, Palestin, và cuối cùng đến
Châu Âu.
Bưởi được trồng rộng rãi tại nhiều nơi trên thế giới do chúng có giá trị dinh
dưỡng cao. Theo Saunt (1990) và Jorgenson (1984) miền Nam Trung Quốc là nơi
bưởi được trồng rộng rãi và phân bố khắp các nước Đông Nam Á.
Tuy nhiên, theo Nguyễn Văn Kế (1997) chính các nước Đông Nam Á (Thái
Lan, Malaysia) là nơi xuất xứ của bưởi từ đó lan sang Trung Quốc, Ấn Độ và Iran.
Song cho đến nay do sự phân bố rộng rãi khắp các vùng trên thế giới nên chưa có
thông tin nào xác định chính xác được nguồn gốc của bưởi.
2.1.1.2 Phân loại:
Ngành hạt kín: Angiospemae
Lớp hai lá mầm: Decotyledones
Bộ : Rutales
Họ: Rutaceae
Tên khoa học: Citrus grandis Ocbeck

xv


2.1.1.3 Đặc điểm hình thái của cây bưởi:

Giáp phần phía trong ngoại quả bì, lớp này gồm nhiều tầng tế bào hợp thành, có
màu trắng, vàng nhạt hay hồng nhạt. Trái càng lớn thì phần mô này càng xốp.

xvi


 Nội quả bì:
Gồm có tâm bì hay múi được bao quanh bởi lớp vách mỏng trong. Bên trong vách
là tép phát triển và chứa đầy dịch nước, dịch nước chứa đường và acid (chủ yếu là
acid citric).
2.1.1.4 Sơ lược về các giống bưở dùng trong thí nghiệm
(a) Bưởi Đường Lá Cam: Bưởi này được trồng nhiều ở Biên Hòa (Đồng
Nai), hiện nay là một trong những giống
bưởi chủ lực trong các nhà vườn bưởi
miền Đông Nam Bộ, được trồng khá tập
trung ở huyện Vĩnh Cữu và huyện Tân
Uyên.
Tán cây tròn đều, phân bố thấp, cành đều,
lá xanh đậm giống lá cam, phiến hình
mác, lá hình tim, bìa lá có khía tròn. Quả
Hình 2.1: Quả bưởi Đường Lá Cam

hình quả lê thấp, màu xanh vàng khi chín,
vỏ láng, dễ bóc, tép quả rất dễ tróc, màu
vàng nhạt hoặc đồng nhất. Nước quả nhiều
hương vị thơm, rất ngon. Khối lượng quả
trung 1.3kg. Năng suất 400 quả/cây. Đây
là giống đã được hai giải thưởng: giải I
năm 1995 kỳ hội chợ Nông Nghiệp Quốc
Tế tổ chức tại Cần Thơ và giải B trong kỳ

ruột mang đặc trưng của giống nhưng có thể nhằm màu của bưởi Da Xanh, Hồng
Đào và các giống bưởi ruột hồng khác.
2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên cây có múi
2.2.1 Bệnh do vi khuẩn và virus gây ra
Theo Roistacher (1993), các bệnh truyền nhiễm trên cây có múi qua nhân giống
được phân thành 4 nhóm:
Nhóm

1

2

Tên bệnh

Tác nhân gây bệnh

Đặc tính

VàngvLá Greening

Vi khuẩn mạch dẫn Liberobacter

Gây thiệt hạinnặng.

Tristeza

Virus Tristeza

Côn trùng là môi


Psorosis

Viroid Ophio

qua đường cơ học

Psorosis A

Ophio

Bệnh có thể kiểm

Mồng.gà Cristacortis

Virus

soát được qua việc

Tatter RLMaf

xviii


3

Đá cứng

sử dụng cây giống

Concave gum


xix


nhưng hướng giải quyết còn nhiểu khó khăn, thế nên ước tính mỗi năm chỉ riêng ở
vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long thiệt hại khoảng 180 tỷ đồng.
Hiện cả trong, ngoài nước đã có nhiều nghiên cứu về bệnh và xác định bệnh lây
truyền qua 2 con đường là mắt ghép và côn trùng truyền bệnh. Theo báo cáo
Garnier và cộng tác viên tác nhân gây bệnh VLG là vi khuẩn Gram âm hiện diện
trong mô libe. Đặc tính của dòng khuẩn này được xác định thông qua việc định vị

chuỗi gene 16S ribosome DNA và protein trong ribosome.
Hình 2.4: Vi khuẩn nhuộm Gram
Có 2 loài vi khuẩn gây bệnh VLG trên CCM: 1.dòng khuẩn gây hại ở Châu Phi
Candidatus Liberibacter africanus do rầy chổng cánh Trioza erytreae là môi giới truyền
bệnh, dòng vi khuẩn này mẫn cảm với khí hậu nóng, thể hiện triệu chứng bệnh ở nhiệt độ
khoảng 22-240C . 2.dòng khuẩn Châu Á (có Việt Nam) Candidatus Liberibacter
asiaticus do rầy chổng cánh Diaphorina citri là môi giới truyền bệnh ( Aubert và
Quilici,1984; Bové và cộng sự, 1980). Dòng khuẩn này được xếp vào nhóm chống chịu
với khí hậu nóng nhiệt độ thích hợp thể hiện triệu chứng bệnh từ 27-320C.
Rầy chổng cánh thuộc loại côn trùng chích hút, biến thái không hoàn toàn.RCC có
kích thước 3,2 – 3,5 mm, màu nâu xám, có 9-10 đốt râu màu nâu đỏ, đầu có 2 mảnh
nhọn nhô ra phía trước, cánh xếp thành hình mái nhà.Chúng thích hợp với điều kiện
nhiệt độ 30,90C, ẩm độ 73,7%.

xx


Hình 2.5: Ấu trùng RCC



Hình 2.9: Triệu chứng gân trong trên lá chanh
Bệnh gây ra do Closterovirus, có kích thước dài nhất 11x2000 nm, môi giới
truyền bệnh trung gian là rầy mềm như: rầy mềm nâu (Toxoptera citricida Kirkaldy)
gây bệnh trên CCM, Aphisgossypii Glover trên dưa, hay 2 loại côn trùng Aphis
citricolaVan der Goot và Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe cũng có khả
năng lây truyền bệnh Tristeza nhưng ở mức thấp. Ngoài ra bệnh còn lây truyền qua
chiết ghép. Phần lớn các loại CCM đều nhiễm bệnh này nhưng một số CCM thuộc
họ cây có ba lá hoặc cây lai của cây ba lá có khả năng kháng bệnh này khi được
ghép gốc chanh chua.

xxii


Hình 2.10: Virus gây bệnh Tristeza

Hình 2.11: Rầy mềm truyền

bệnh
Biểu hiện virus tập trung làm hỏng mạch dẫn nhựa libe trong thân, sau đó xuống rễ
làm suy dinh dưỡng, gây rụng lá, chết đọt, lùn cây, thối rễ và chết. Mầm bệnh có thể
tiềm ẩn mãn tính trong cây và biểu hiện qua hình thái cây sau khi trồng một thời
gian. Nếu cây bị nhiễm được ghép trên gốc ghép kháng bệnh thì vẫn có khả năng
phục hồi.
2.2.1.3 Bệnh ghẻ sẹo
Bệnh ghẻ sẹo cũng là bệnh khá phổ biến, một trong những nguyên nhân gây thiệt
hại nặng nề cho vườn CCM. Tác nhân gây bệnh là nấm Elsinoe fawcettii gây ra.
Bệnh biểu hiện trên cành non, lá, trái.
Triệu chứng: các đốt ghẻ nhỏ xuất hiện trên cao bề mặt lá, lộ ra mặt dưới lá,
vết bệnh có màu vàng trơn, các vết bệnh loét nhô cao trên bề mặt phiến lá, đôi khi

chung quanh vết bệnh có màu viền sáng nhưng bề mặt lá không nhăn nheo, đây là
điểm để phân biệt với bệnh ghẻ sẹo. Sâu vẽ bùa là tác nhân phụ gây nên bệnh,
chúng tấn công trên

lá non và tạo ra

những vết thương là

nơi vi khuẩn dễ

xâm nhập vào tế

bào cây và gây

hại.

xxiv


Hình 2.15: Sâu vẽ bùa Phyllocnitis citrella

2.2.2. Bệnh do nấm:

Bệnh

Tác nhân gây bệnh

Triệu chứng biểu

Hình


nấm Capnodium sp.

hiện mụn đen sần
sùi.

xxv