BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHẤT
CHIẾT XUẤT TỪ CỎ MỰC ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN
GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VÂT THỦY SẢN

Họ và tên sinh viên: VŨ THỊ BÌNH THUẬN
Chuyên ngành: Ngư Y
Niên khóa: 2004 – 2008

Tháng 9/2008


KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CỎ MỰC
ĐỐI VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN THỦY SẢN

Tác giả

VŨ THỊ BÌNH THUẬN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư Nuôi Trồng Thủy Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. LƯU THỊ THANH TRÚC
TS. NGUYỄN NGỌC HẠNH

Tháng 9 năm 2008

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các cao cỏ mực đối với các vi khuẩn:
Aeromonas hydrophyla, Staphylococcus spp, và Edwarsiella ictaluri (VL33, NLF108,
NLF109, NLF110, NLF111).
Kết quả cho thấy:
Cao CM2 có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn VL33, NLF108,
NLF109, NLF110 và NLF 111.
Cao CM3 có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn: Staphylococcus
spp, A. hydrophyla, VL33, NLF108, NLF109, NLF110 và NLF111.
Cao CM4 có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn: Staphylococcus
spp, VL33, NLF108, NLF109, NLF110 và NLF111.
Nồng độ ức chế tối thiểu của cao CM2 đối với vi khuẩn như sau: VL33:
625µg/ml, NLF108: 312,5µg/ml, NLF109:312,5µg/ml, NLF110: 520,833µg/ml,
NLF111: 520,833µg/ml.
Nồng độ ức chế tối thiểu của cao CM3 với vi khuẩn như sau: Staphylococcus
spp: 2500µg/ml, A. hydrophyla: 1042,667µg/ml, VL33:416,667µg/ml, NLF108:
156,250µg/ml,

NLF109:

208,333µg/ml,

208,333µg/ml.

iii

NLF110:

208,333µg/ml,

NLF111:


Chương 1 GIỚI THIỆU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Sở Lược Về Vi Khuẩn Aeromonas

3

2.1.1 Dấu hiệu bệnh lý

4

2.1.2 Phân bố

5

2.2 Sơ Lược Về Vi Khuẩn Streptococcus


2.4 Sơ Lược Về Vi Khuẩn Vibrio

9

2.4.1 Đặc Điểm

9

2.4.2 Dấu hiệu bệnh do vi khuẩn Vibrio

10

2.4.3 Phân Bố

11

2.5 Sơ lược về vi khuẩn Staphylococcus

11

2.5.1 Đặc điểm

11

2.5.2 Triệu chứng bệnh

12
v



18

2.7.2 Cơ chế của sự kháng thuốc

18

2.7.3 Kiểm soát sự kháng thuốc

19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

21

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện Đề Tài

21

3.1.1 Thời gian

21

3.1.2 Địa điểm

21

3.2 Vật Liệu

21


27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

31

4.1 Kết Quả Sàng Lọc Kháng Sinh Đồ Của Cao Chiết Xuất Từ Cỏ Mực

31

4.2 Kết Quả Thử Nghiệm Kháng Sinh Đồ Của Cao Chiết Xuất Từ Cỏ Mực Đối Với A.
hydrophyla

32

4.2.1 Cao CM2

32

4.2.2 Cao CM4

33

4.2.3 Cao CM3

33
vi



37

4.5.2 Cao CM2

38

4.5.3 Cao CM3

41

4.5.4 Cao CM4

42

4.6 Kết Quả Xác Định Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu

44

4.6.1 Cao CM2

44

4.6.2 Cao CM3

45

4.6.3 Cao CM4

46



Bảng 3.1: Cách pha ống chuẩn McFarland

25

Bảng 3.2 Cách pha loãng cao cỏ mực

30

Bảng 3.3: Cách làm MIC

30

Bảng 4.1: Kết quả sàng lọc kháng sinh đồ của cao chiết xuất từ cỏ mực

31

Bảng 4.2: Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn của cao CM2 ở các nồng độ thử
nghiệm trên vi khuẩn A. hydrophyla

32

Bảng 4.3: Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn của cao CM4 ở các nồng độ thử
nghiệm trên vi khuẩn A. hydrophyla

33

Bảng 4.4: Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn của cao CM3 ở các nồng độ thử
nghiệm trên vi khuẩn A. hydrophyla


39

Bảng 4.11: Kết quả so sánh mức độ nhạy cảm giữa các chủng vi khuẩn Edwarsiella
ictaluri với các loại cao cỏ mực ở nồng độ 3000 µg/15µl

40

Bảng 4.12: Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn của cao CM3 trên vi khuẩn
Edwarsiella ictaluri

41
viii


Bảng 4.13: Kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn của cao CM4 trên vi khuẩn
Edwarsiella ictaluri

43

Bảng 4.14: Nồng độ ức chế tối thiểu của cao cỏ mực đối với vi khuẩn

45

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: E. ictaluri dưới kính hiển vi điện tử


Hình 3.6: Cách đọc kết quả MIC

29

Hình 4.1: Kết quả thử kháng sinh đồ của CM3 đối với E. ictaluri

38

Hình 4.2: Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ của CM3 đối với E. ictaluri

42

Hình 4.3: Kết quả thử kháng sinh đồ của CM4 đối với E. ictaluri

43

Đồ thị 4.1:Nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất chiết xuất từ cỏ mực đối với vi khuẩn 44
Hình 4.4: Kết quả MIC của cao CM2 trên vi khuẩn E. ictaluri

45

Hình 4.5: Kết quả MIC của cao CM3 trên vi khuẩn E. ictaluri

46

Hình 4.6: Kết quả MIC của cao CM4 trên vi khuẩn E. ictaluri

46

x


Việc sử dụng kháng sinh còn gây suy thoái môi trường.
Trước thực tế đó một yêu cầu được đặt ra là phải có chất mới vừa có tác dụng
trị bệnh cho thủy sản nuôi vừa thân thiện với môi trường.
Được sự phân công của Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm chúng tôi
đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chất chiết xuất từ cỏ
mực đối với một số vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản ”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Kiểm tra mức độ nhạy cảm của một số vi khuẩn: Edwardsiella ictaluri,
Aeromonas hydrophyla, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Streptococcus spp,
Staphylococcus spp đối với hợp chất chiết xuất từ cỏ mực.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sở Lược Về Vi Khuẩn Aeromonas
Giống Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae. Trong giống Aeromonas có hai
nhóm:
Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở cá
vùng ôn đới.
Nhóm 2: Là các loài Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophyla, A. caviae, A.
sorbia. Đặc tính chung của các loài vi khuẩn này là di động nhờ có một tiên mao. Vi
khuẩn gram âm dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 x 1,0 – 1,5 µm. Vi
khuẩn yếm khí tùy nghi, cytochrom oxidase dương tính, khử nitrate, không mẫn cảm
với thuốc thử Vibriostat O/129. Tỷ lệ Guanin + Cytozin trong ADN là 57 – 63 mol%.
Ba loài vi khuẩn Aeromonas di dộng có những đặc điểm khác nhau (bảng 2.1).
Sự dung huyết trên máu thỏ của hai loài vi khuẩn A. hydrophyla khác với A. sorbia
(Oliver và ctv, 1981 trích bởi Bùi Quang Tề, 2006). A. hydrophyla dung huyết trên

+

+

-

Sử dụng: L. Histidine

+

+

-

L. Arginine

+

+

-

L. Arabinnos

+

+

-


+

2.1.1 Dấu hiệu bệnh lý
o Hoại tử da và cơ: đốm đỏ xuất huyết
o Vây bị phá hủy: Gốc vây xuất huyết, tia rách nát và cụt dần
o Vẩy dựng (rộp) và bong ra, da xuất huyết
o Xoang bụng sưng to, các cơ quan nội tạng bị xuất huyết và viêm nhũn
(dịch hóa), ruột viêm và chứa đầy hơi
o Đối với từng loài động vật thủy sản có dấu hiệu cụ thể như sau:
Dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên tầng mặt. Da cá
thường đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp. Xuất hiện các đốm xuất
huyết màu đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trắng. Xuất
hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét thường có nấm và ký sinh
trùng ký sinh. Mắt lồi đục hậu môn viêm xuất huyết, bụng có thể trướng to, các vây xơ
rách, tia vây cụt dần.
Giải phẫu nội tạng: Xoang bụng xuất huyết, mô mỡ cá basa xuất huyết nặng.
Gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột, dạ dày, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất
4


huyết. Có trường hợp cá basa hai đoạn ruột lồng vào nhau. Xoang bụng có chứa nhiều
dịch nhờn mùi hôi thối.
Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và “treo râu” đầu hướng lên trên vuông
góc với mặt nước.
Cá bống tượng có hiện tượng da mất hết nhớt gọi là bệnh “tuột nhớt”.
Ở ba ba xuất hiện các vết loét xuất huyết, không có hình dạng nhất định ở xung
quanh và trên mai lưng, phần bụng, các chân có thể cụt hết móng. Bệnh nặng cơ thể ba
ba mềm nhũn hoạt động chậm chạp, khi lật ngửa ba ba không lật sấp lại được. Ba ba ít
ăn hoặc bỏ ăn, sau 1 - 2 tuần chúng bò lên cạn và chết, tỷ lệ chết lên tới 30% - 40%.
Giải phẫu phổi, gan, thận có màu đen (Bùi Quang Tề, 2006).

2.2.3 Biểu hiện bệnh do Streptococcus
Bên ngoài: Dấu hiệu bệnh thay đổi giữa các loài. Tuy nhiên có một số biểu hiện
bất thường như:
o Lờ đờ, bơi xoay vòng, mất định hướng, cơ thể cong gấp khúc
o Giác mạc mờ đục, lồi một hay hai mắt do tích dịch viêm ở trong làm
nhãn cầu bị đẩy ra ngoài
o Bụng trướng to do tích dịch trong xoang bụng
o Ổ mủ xuất hiện ở hàm dưới, gốc vây. Ổ mủ vỡ ra tạo thành loét
o Xuất huyết điểm quanh gốc vây, quanh miệng, quanh hậu môn
o Cá giảm hay không ăn
o Bệnh thường xảy ra trên cá cỡ lớn, cá chết rải rác.
Bên trong:
o Dạ dày, ruột trống, bóng khí phình to
o Gan nhạt màu, thận, lách sưng rất to
o Viêm phúc mạc nên viêm dính các nội quan với nhau và viêm dính thành
bụng
6


o Viêm màng não
o Viêm màng cơ tim, có huyết khối trong ống mạch
o Nhu mô lách bị vi khuẩn tấn công, hư hại
o Trên cơ có nhiều điểm hoại tử đông đặc.
2.3 Sơ Lược Về Vi Khuẩn Edwardsiella
2.3.1 Đặc điểm

Hình 2.1: E. ictaluri dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />Vi khuẩn Edwardsiella thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm, hình
que, kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phản
ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hóa, lên men trong môi trường

+

-

Sinh indole

+

-

Methyl red

+

-

Citrate simmons

-

-

Citrate christensens

+

-

Sinh H2S trong triple sugar iron


những động vật thủy sản khác. Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá tra hương (cỡ từ
4 - 6 cm) đến 5 - 6 tháng tuổi, tỷ lệ tử vong của cá từ 60% - 70%, có trường hợp tới
100% (Bùi Quang Tề, 2003). Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu và
trong nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè.

8


2.3.2 Triệu trứng bệnh do E. ictaluri
* Mức độ nhẹ: Bên ngoài thân cá bình thường không biểu hiện xuất huyết, mắt
hơi lồi nhưng khi mổ ra thì gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng (như đốm mủ). Đó là
biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhất của bệnh mủ gan.
* Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, cá thường nhào lộn và
xoay tròn. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá xuất huyết tất
cả các vây hoặc xuất huyết toàn thân. Có khi cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc lên
khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang cá.
Một số cá bệnh còn biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều bệch lớn, nhỏ trên
da. Số lượng cá chết hằng ngày khá cao và tỷ lệ tăng dần.
2.4 Sơ Lược Về Vi Khuẩn Vibrio
2.4.1 Đặc Điểm

Hình 2.2: Vi khuẩn Vibrio cholerae
(Nguồn:ci.vbi.vt.edu/.../pathogens/V_cholerae_2.html)
Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que
thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. chúng không hình thành
bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh.
Tất cả chúng đều yếm khí tùy nghi và hầu hết là oxy hóa và lên men trong môi
trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc
của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+
kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối,

Ấu trùng tôm và tôm giống có hiện tượng phát sáng khi nhiễm V.
parahaemolyticus và V. harveyi.
10


Xuất hiện các điểm đỏ ở gốc râu, phần đầu ngực, thân, các phần phụ của ấu
trùng giáp xác khi nhiễm V. alginolyticus.
Ấu trùng bào ngư khi nhiễm Vibrio spp chuyển từ màu hồng sang màu đỏ.
Cua nhiễm Vibrio spp sau 24 – 48 giờ trong máu có hiện tượng vón cục (kết
tủa) gồm tế bào máu và vi khuẩn.
2.4.3 Phân Bố
Vibrio spp thường gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn và nước ngọt: Cá,
giáp xác, nhuyễn thể… Những vi khuẩn này thường là tác nhân cơ hội, khi động vật
thủy sản bị sốc do môi trường biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như: virus,
nấm, ký sinh trùng. Động vật thủy sản yếu không có sức đề kháng, các loài vibrio spp
cơ hội gây bệnh nặng làm động vật thủy sản chết rải rác tới hàng loạt.
Mùa vụ xuất hiện bệnh tùy theo loài và địa điểm nuôi. Theo nghiên cứu của tác
giả nước ngoài và Việt Nam Vibrio spp tìm thấy phổ biến ở nước biển và ven bờ, trong
nước bể ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ương ấu trùng.
Trong bể ương ấu trùng Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng
mặt, do đó khi xi phông đáy có tác dụng giảm mật độ Vibrio trong bể ương.
2.5 Sơ lược về vi khuẩn Staphylococcus
2.5.1 Đặc điểm
Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu, đường kính vi khuẩn từ 0,5 –
1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn hoặc từng chùm không đều
giống như chùm nho. Đây là loại vi khuẩn không di động, không sinh bào tử thường
cư trú trên da và màng nhầy của động vật máu nóng. Staphylococus là những vi khuẩn
hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, có cả sự hô hấp, trao đổi khí và lên men. Chúng cho phản
ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều loại carbohydrat khác nhau tạo acid
lactic nhưng không sinh hơi. Khuẩn lạc trên môi trường TSA (Triptic Soy Agar)

Lá nguyên, mọc đối, hình mũi mác, màu xám đen và nhăn nheo, dài 2,5 – 5 cm.
Hai mặt lá đều có lông cứng ngắn, màu trắng. Mép phiến lá có răng cưa to và nông.
Gốc phiến lá men xuống nên trông như không có cuống lá.
Cụm hoa hình đầu, màu trắng, đường kính 4 - 8 cm, mọc ở kẽ lá hay ngọn cành.
Đầu mang hai loại hoa: hoa cái hình lưỡi nhỏ ở ngoài, hoa lưỡng tính hình ống ở trong,
có khi các hoa đã rụng, chỉ còn lại bao hoa và trục cụm hoa. Cây ra hoa từ tháng 7 đến
tháng 9.
Quả đóng hình trái xoan hơi hẹp, đầu cụt, có màu đen, dài 3 mm, rộng 1 - 1,5
mm. Quả từ tháng 9 đến tháng 10.
Cây rất đa dạng. Thân có thể thắt lại ở mấu và phình ra ở dóng. Lá có khi to
bản, hình bầu dục hoặc hình trứng.
2.6.2 Phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, cỏ mực phân bố rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng đồng bằng, trung du
và miền núi, đến độ cao 1500 m (ở các tỉnh phía Nam). Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể
chịu bóng râm, thường mọc lẫn với các loại cỏ thấp, trên đất ẩm ở bãi sông, ruộng
trồng hoa màu, ven đường đi, bãi hoang quanh làng bản… Ra hoa quả nhiều hàng
năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt. Bên cạnh đó với khả năng mọc chồi gốc và
phân cành nhiều, cây dễ dàng phát triển, tạo thành đám bò lan trên mặt đất.
Ngoài việc thu hái từ nguồn hoang dại, trước đây cỏ mực chỉ được trồng lẻ tẻ
với quy mô ở các gia đình. Gần đây, cây đã bắt đầu được trồng phổ biến hơn ở một số
nơi.
Cỏ mực được nhân giống bằng hạt. Hạt chín rải rác vào mùa hè và mùa thu, vì
vậy hạt chín đến đâu thu ngay đến đó, đem phơi khô và bảo quản đến mùa xuân năm
13


sau thì gieo. Hạt cỏ mực rất nhỏ nhưng tỷ lệ nảy mầm cao. Thường áp dụng cách gieo
hạt trong vườn ươm, sau đó đánh cây con đi trồng. Đất vườn ươm và đất trồng cần làm
thật tơi nhỏ. Nên bón phân lót (10 – 15 tấn phân chuồng/ha), lên luống như luống cải
rồi trồng với khoảng cách 20 x 10 cm hay 20 x 15 cm. Sau khi cây bén rễ, có thể dùng