BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC
DẪN XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ
CURCUMIN

Họ và tên sinh viên: ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI

Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Niên khóa: 2005-2009

Tháng 08/2009


ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN
XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN

Tác giả

ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
Cấp bằng Kỹ sư ngành
Công nghệ hóa học

năm học.
Kính chúc tất cả mọi người sức khỏe và thành công !

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ
curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học
Bách Khoa TP. HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009.
Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn
xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực dược
phẩm.
Tiến trình thực hiện đề tài như sau:
1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid
- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội).
- Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy,
xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% và có
thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiếp theo.
2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine
– Tổng

hợp

dẫn

xuất


So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt

tính sinh học của curcumin.
Kết quả:
Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC và HBTC đều thể hiện hoạt tính
kháng oxi hoá trong thử nghiệm DPPH và MDA tuy nhiên hoạt tính thấp hơn Cur.
DFPHC và Cur đều thể hiện hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào
Hep – G2.
Ngoài ra DFPHC và HBTC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhưng
hoạt tính này không đáng kể với các chủng vi khuẩn, vi nấm đã khảo sát.

iv


MỤC LỤC
Trang tựa ......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................................................ii
Tóm tắt........................................................................................................................... iii
Mục lục ............................................................................................................................v
Danh sách các từ viết tắt.............................................................................................. viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi
Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................... xii
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................2
1.3. Nội dung đề tài .........................................................................................................2
1.4. Yêu cầu .....................................................................................................................3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................4

3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH...................35
3.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA ................37
3.2.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC...................38
3.2.4.4. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư....................................................................39
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................41
4.1. Phân lập curcumin ..................................................................................................41
4.1.1. Kết tinh lại curcuminoid......................................................................................41
4.1.2. Sắc ký cột.............................................................................................................42
4.1.3. Nhận danh cấu trúc hóa học ................................................................................43
4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin ...........................................................43
4.1.3.2. Biện luận cấu trúc của curcumin ......................................................................44
4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin ........................................46
4.2.1. Theo dõi phản ứng...............................................................................................46
4.2.2. Sắc ký cột.............................................................................................................47
4.2.3. Nhận danh cấu trúc ..............................................................................................48
4.2.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng.................................................................................48
4.2.3.2. Biện luận cấu trúc của HBTC...........................................................................48
4.3.2. Sắc ký cột.............................................................................................................52
4.3.3. Biện luận cấu trúc ................................................................................................53
vi


4.3.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng.................................................................................53
4.3.3.2. Biện luận cấu trúc của DFPHC ........................................................................53
4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học........................................................................56
4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa.......................................................................................56
4.4.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH ....................56
4.4.1.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA................58
4.4.2. Hoạt tính kháng ung thư ......................................................................................60
4.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.....................................................................61


HBTC

: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin

DFPHC

: 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin

OD

: Mật độ quang

HTCO

: Hoạt tính kháng oxi hoá

CS

: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được
thử tính theo % so với chất đối chứng

IC50

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư
hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)

IC70

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid ....................................................4
Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur ........................................6
Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH ..............................................................................8
Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm ......................................................9
Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur ...................................................................................10
Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá ................................................................................11
Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine
vào pH môi trường. ................................................................................................................12
Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin ....................................12
Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch ...................................................................13
Hình 2.10: Phức Cur với kim loại ........................................................................................13
Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do .......................................................................14
Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u .......................16
Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur......................................................17
Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC.......................................................................................18
Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC ....................................................................................18
Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư khác
nhau (theo phương pháp MTT) ............................................................................................18
Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN ............19
Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................20
Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid ........................20
Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin ................................................................21
Hình 2.20: Hydrazinocurcumin .....................................................................................21
Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC...............................................................................21
Hình 3.1: Phương pháp tính Rf .............................................................................................27
Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá ...............................36
Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA ...................................................................................37
Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh .......................41
ix

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur .........................................7
Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................20
Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại ......................................................................................25
Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi .........................................................................26
Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH ............................................................36
Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh .........................................................41
Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur .....................................................................44
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin ........................................................................45
Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC.................................................................48
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC .............................................................................49
Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC .............................................................53
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC ..........................................................................54
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur theo
phương pháp DPPH ...............................................................................................................56
Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH ...............56
Bảng 4.10: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH ....................57
Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA ...................58
Bảng 4.13: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA .....................59
Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
DFPHC, Cur với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD......................................................60
Bảng 4.15: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của HBTC, DFPHC, Cur đối với một số
chủng vi khuẩn, vi nấm .........................................................................................................61

xi


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu. ........................................................23
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin .............................................................................24
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) .................29

1


1.2. Mục tiêu đề tài
- Tổng hợp các dẫn xuất imine: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và
2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin.
- Khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp.
•

Hoạt tính kháng ung thư.

•

Hoạt tính kháng oxy hóa.

•

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.

1.3. Nội dung đề tài
Từ các mục đích đã đưa ra đề tài sẽ được triển khai theo các nội dung cơ bản
sau:
a. Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin.
– Phân lập curcumin từ bột curcuminoid.
– Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm
chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
b. Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất
– Tổng

hợp

–

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.

–

So sánh các hoạt tính của dẫn xuất tổng hợp được với hoạt tính sinh học

của curcumin.

2


1.4. Yêu cầu
–

Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết.

–

Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.

–

Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin.

–

Xác định cấu trúc của các dẫn xuất bằng phổ MS, IR và NMR.


OH

OH

R1

R2
O

O

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7]
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]
Hợp chất

R1

R2

Cur

OCH3

OCH3

C21H20O6

368

DMC

các thành phần của curcuminoid ra là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thiết thực.
Hiện nay đã có nhiều tác giả dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các
thành phần của curcuminoid.
Opa vajragupta và cộng sự [8] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc
ký cột silica gel 60G, 0.063-0.200mm với hệ dung môi CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2
v/v/v). Theo phương pháp này, Cur được rửa giải đầu tiên, kế tiếp là hỗn hợp của
Cur và DMC, cuối cùng là BDMC tinh. DMC được tách ra khỏi hỗn hợp giữa DMC
và Cur bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5 v/v ).
G. K. Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid
bằng sắc ký cột silica gel. Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi
benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42
v/v). Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175
- 176, 231 - 232oC.
W. Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao
ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl3,
sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH3OH. Thu được các phân
đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC).
L. Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính
chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt. Hỗn hợp curcuminoid (Merck)
được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH (5:1 v/v), hiệu suất quá
trình kết tinh ~ 40%.
Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ
silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), dung môi rửa giải là
CH2Cl2. Các phân đoạn tinh khiết được xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý.

5


Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid [11]
Điểm chảy (oC)

Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng
và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan
O

OH

H2AHO

OH

H3CO

OCH3
O-

O

HA2O-

HO

H3CO

OCH3
O-

O

A3-

O-


-

OH

OCH3

as radical

O

O
HO

OH

HO
OCH3

OCH3
feruloyl methane

condensation product

CHO

ferulic acid

O

HO

H3CO

+ H2
Ni (PtO2)

OCH3
O

OH

n = 1: dihydrocurcumin
HO

OH

H3CO

OCH3

.

O

OH

. n = 2: tetrahydrocurcumin
HO

OH



(NH2-NH2),

semicarbazide


(NH2NHCONH2) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương
ứng [2,3,16,17].
Cơ chế phản ứng imine hoá
O-

O

OH
+

±H
R

C

Y

R

R'NH2

H3O+

C

C

Y

NR'

H3O+

H2O
H

N

R'

R

C

Y

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16]
Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên
tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm
carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành
hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation
ammonium. Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian
bền hơn là carbinolamin. Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho
cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh
ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn


OH

H3CO

OCH3
N

NH

Pyrazole curcumin

Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazole Cur [18].

12