BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
(Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ THANH VÂN
Niên khóa:

Tháng 08/2009

2005 – 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG

Cùng toàn thể lớp CNSH 31 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tháng 08 năm 2009
Phạm Thị Thanh Vân

iii


TÓM TẮT
Melamine xuất hiện trong thực phẩm nhất là sữa bột cho trẻ em và thức ăn cho
các thú cưng gây nguy cơ tử vong và sạn thận cao là vấn đề đáng lo ngại, tạo ra tâm
trạng hoang mang, lo lắng cho người dân, các doanh nghiệp làm ăn chân chính bị thiệt
hại không ít. Xuất phát từ tình hình trên, được sự cho phép của Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây
dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc bằng phương
pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)”.
Melamine là một hợp chất hữu cơ có hàm lượng đạm cao được thêm vào thực
phẩm là một hành vi gian lận nhằm làm tăng độ đạm tổng số. Khi melamine được hấp
thụ lâu ngày trong cơ thể và với nồng độ cao có thể gây nên các bệnh về sỏi thận và
sỏi bàng quang. Việc cố tình thêm melamine vào thức ăn cho vật nuôi là nguyên nhân
của những cái chết hàng loạt trên chó và mèo. Chúng tôi đã đưa ra quy trình phân tích
hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc trên thiết bị GC-MS sử dụng hệ thống
Aligent 6890 GC, 5973 MS, bộ bơm mẫu tự động 7689 với cột mao quản
Aligent ZB-5ms 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm. Dựa trên quy trình đã công bố bởi cơ
quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U.S.FDA), 2008, áp dụng trên các
loại vật liệu khô (sữa bột, thức ăn gia súc…). Mẫu được chiết với hỗn hợp
Diethyamine/H2O/Acetonitrile (DEA/H2O/ACN) và được tạo dẫn xuất Trimethysilyl
(dẫn xuất TMS) trước khi đưa vào phân tích trên hệ thống GC-MS. Khoảng tuyến tính

Trang
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... iii
TÓM TẮT......................................................................................................................iv
SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH............................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu ....................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3
2.1. Giới thiệu về melamine ...........................................................................................3
2.1.1. Melamine là gì ......................................................................................................3
2.1.2. Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine ....................................................3
2.1.3. Mục tiêu sử dụng của melamine...........................................................................4
2.1.4. Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm .......................................................4
2.1.5. Melamine gây độc ra sao......................................................................................5
2.1.6. Có quy định về sử dụng melamine hay không .....................................................6
2.1.7. Có cách nào để nhận diện melamine hay không ..................................................8
2.2. Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký ................................................................9
2.2.1. Lịch sử phương pháp sắc ký.................................................................................9
2.2.2. Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký .............................................................9
2.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký......................................................................10
2.3. Một số phương pháp sắc ký sử dụng trong phân tích melamine...........................12
2.3.1. Sắc ký lỏng cao áp..............................................................................................12
2.3.2. Sắc ký lỏng ghép khối phổ .................................................................................13
2.3.3. Sắc ký khí ghép khối phổ ...................................................................................13
2.3.3.1. Ứng dụng GC-MS ...........................................................................................14

4.4. Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền sữa ........................................34
4.5. Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền thức ăn gia súc......................38
4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) melamine của phương pháp........................................41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43
5.1. Kết luận..................................................................................................................43
vii


5.2. Đề nghị ..................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................45
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

: Acetonitrile

BSTFA

: Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

C

: Nồng độ (ppb)

DACP


LC-MS-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần
LOD

: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

S/N

: Signal-to-Noise ratio (Tỉ số tương đối của tín hiệu so với nhiễu nền)

S

: Diện tích peak

SIM

: Selected ion monitoring (Chế độ quét chọn lọc)

SPE

: Solid phase extraction (Cột chiết pha rắn)

Sylon BFT : 99 % BSTFA + 1% TMCS
TB

: Trung bình

TCMS

: Trimethylchlorosilane


Bảng 4.4 Tương quan tỉ lệ trung bình C, V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn trên sữa..37
Bảng 4.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn dựa trên nồng độ melamine tri-TMS.........38
Bảng 4.6 Kết quả phân tích melamine trên thức ăn gia súc........................................40
Bảng 4.7 Tương quan tỉ lệ trung bình C,V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn ................40
Bảng 4.8 Thời gian lưu và diện tích của các nhiễu nền ...............................................41

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử melamine.............................................................................3
Hình 2.2 Quá trình tách trong sắc ký. ............................................................................6
Hình 2.3 Kết hợp melamine và acid cyanuric .............................................................10
Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC...............................................................12
Hinh 2.5 Liên hợp GC-MS. .........................................................................................14
Hình 2.6 Cấu tạo chính của máy sắc ký khí. ...............................................................15
Hình 2.7 Thành phần cơ bản của hệ thống khối phổ. ..................................................16
Hình 2.8 Sơ đồ phổ khối. .............................................................................................17
Hình 3.1 Nền mẫu sử dụng làm thí nghiệm.................................................................22
Hình 3.2 Máy sắc ký khí ghép khối phổ Aligent.........................................................23
Hình 3.3 Quá trình tạo dẫn xuất melamine tri-TMS với Sylon BFT...........................28
Hình 4.1 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,16 phút), DACP 1000 ppb (10,29 phút)..31
Hình 4.2 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,2 ...............................................31
Hình 4.3 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 10,3........................................31
Hình 4.4 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,91 phút), DACP 1000 ppb (11,07 phút)..32
Hình 4.5 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,9 ...............................................32
Hình 4.6 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 11,07......................................32
Hình 4.7 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình U.S.FDA......33
Hình 4.8 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình cải tiến .........33

ngàn trẻ em bị bệnh, một số đã thiệt mạng vì uống sữa nhiễm hóa chất này. Thức ăn
gia súc nhiễm melamine đã gây ra sỏi thận và suy thận cấp ở chó và mèo. Đặt ra nhu
cầu bức thiết là phải có một phương pháp có thể xác định chính xác chất này trong
thực phẩm để có những giải pháp kịp thời, tránh ảnh hưởng tới sức khỏe con người và
vật nuôi.
Việc phân tích chính xác melamine trong nền mẫu không phải là dễ dàng kể cả
khâu tách chiết melamine ra khỏi nền mẫu và ở khâu vận hành thiết bị. Cho đến nay,
ngoài việc sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc thì chỉ có ba kỹ thuật tương đối
hiện đại để phân tích melamine trong thực phẩm: phương pháp sắc ký lỏng HPLC với
đầu dò UV chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm lượng melamine tương đối
lớn. Còn hai phương pháp nữa là sắc ký khí ghép khối phổ và sắc ký lỏng ghép khối
phổ. Với những phương pháp này, người ta cũng có thể gặp trở ngại khiến kết quả đạt
thấp hơn trị số thực, nếu không giải quyết tốt vấn đề chiết tách melamine ra khỏi
protein thực phẩm.
Từ thực tế trên, chúng tôi đã xây dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine
trên sữa và thức ăn gia súc bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), dựa
trên quy trình đã được công bố bởi U.S.FDA, 2008.

1


1.2. Yêu cầu
Tạo đựợc mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao.
Sử dụng thiết bị GC-MS của Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi
Trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM để tiến hành phân tích định lượng
melamine.
1.3. Nội dung thực hiện
 Dựng đường chuẩn 5 điểm melamine.
 Đo hàm lượng đạm tổng số trên 2 nền mẫu đem phân tích.
 Xây dựng quy trình phân tích, xác định hiệu suất thu hồi của melamine trên

- Acid cyanic trùng hợp hóa tạo ra melamine và carbon dioxid
6HCNO → C3H6N6 + 3CO2 (Nguyễn Bá Tiếp, 2008).

3


2.1.3. Mục tiêu sử dụng của melamine
Melamine không phải là chất phụ gia thực phẩm trong tất cả các loại thực phẩm
và đồ uống. Nó được sản xuất ra để phục vụ cho các lĩnh vực công nghiệp như:
Melamine được sử dụng để sản xuất ra melamine resin (một loại polymer công
nghiệp).
Melamine cũng được sử dụng để sản xuất keo dán gỗ trong công nghệ gỗ.
Trong ngành công nghiệp chất dẻo, người ta cũng sử dụng melamine để sản xuất
dụng cụ gia đình như: ca nhựa, dĩa nhựa, kính mica… nhờ có phản ứng melamine
formaldehyde tạo ra một loại polymer tổng hợp chịu nhiệt, chống cháy, làm chất chậm
cháy. Melamine cũng là thành phần chính trong màu mực in trên các dụng cụ bằng
chất dẻo.
Trong lĩnh vực xây dựng, melamine cũng được sử dụng trong sản xuất beton chịu
lực, vì nó làm giảm hàm lượng nước, hạn chế tạo xốp để làm tăng độ bền của beton.
Do sở hữu hàm lượng nitơ cao nên ngay từ những năm 50, melamine được sử
dụng làm phân bón. Tuy nhiên, do phản ứng thủy phân melamine nên tác dụng của nó
đối với đất trồng rất hạn chế. Melamine cũng có mặt trong thuốc có gốc asen được
dùng trong điều trị xoắn trùng châu Phi. Đã từ lâu người ta dùng melamine như một
nguồn cung cấp nitơ không phải là protein cho động vật nhai lại (tuy nhiên, quan điểm
về ứng dụng này còn chưa nhất quán).
Dẫn xuất của melamine là acid cyanuric, cũng được sản xuất ra với số lượng lớn
để làm nguyên liệu sản xuất chất dẻo cùng với melamine, sản xuất thuốc nhuộm, thuốc
diệt cỏ và làm thuốc chống khuẩn, nó còn được sử dụng để làm chất ổn định, tẩy uế
nước trong các bể bơi…(Dương Thanh Liêm, 2008).
2.1.4. Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm ?

Thêm một câu hỏi được đặt ra: "Phải chăng melamine với 3 nhóm amin (-NH2)
có thể kết hợp với phân tử protein, tạo thành khối lớn hơn có tác dụng tăng độ nhớt
khiến người mua có cảm giác là sữa đặc hơn” (Hương Cát, 2008).
2.1.5. Melamine gây độc ra sao ?
Theo tài liệu mới nhất mà Văn phòng đại diện WHO tại Việt Nam vừa công bố,
dựa trên những nghiên cứu ngẫu nhiên về thức ăn vật nuôi có nhiễm melamine với sự
phát triển của sỏi thận và suy thận cấp sau đó ở chó và mèo, đã cho thấy rằng,
melamine và các chất cấu trúc tương tự như nó, như axit cyanuric có thể kết hợp với
nhau tạo ra tinh thể. Với liều lượng cao, đạt ngưỡng tập trung, thì tinh thể này sẽ hình
thành và gây tác hại.

5


Những nghiên cứu tiếp theo trên động vật cho thấy, khi chúng được cho ăn hỗn
hợp của melamine và axit cyanuric, sẽ hình thành chất rắn trong ống thận, cuối cùng
làm tắc nghẽn, gây ra suy thận và hoại thận.

Hình 2.2 Kết hợp melamine và acid cyanuric
(Thanh Loan, 2008).
Về độc tính, melamine không được trao đổi chất, mà nhanh chóng bài tiết qua
nước tiểu. Tuy chưa có dữ liệu về độc tính của melamine qua đường miệng ở người,
nhưng các nhà khoa học đã thấy có tác hại trên chuột. Tệ hại hơn, Trung tâm Quốc tế
nghiên cứu ung thư (IARC) đã có kết luận rằng có bằng chứng trên động vật thí
nghiệm cho thấy, melamine có sản sinh chất gây ung thư trong cùng điều kiện mà nó
sản sinh ra sỏi bàng quang (Thanh Loan, 2008).
2.1.6. Có quy định về sử dụng melamine hay không ?
Melamine được sử dụng trong công nghiệp nhựa, sản xuất keo dán và các sản
phẩm chịu nhiệt, dụng cụ nhà bếp, làm chất chống cháy… chứ không phải là chất phụ
gia thực phẩm. Mục đích của việc đưa melamine vào thức ăn cho động vật và thực

chứa sữa và các thành phần dẫn xuất từ sữa. Theo đó, xác lập ngưỡng TDI là 0,35 mg
melamine/1 kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày.
Như vậy, nếu sử dụng TDI là 0,5 mg melanine/1 kg trọng lượng cơ thể, tổng mức
melamine phơi nhiễm mỗi ngày có thể chịu được của một người nặng 50 kg là 25 mg
melamine. Lúc đó, ngưỡng này sẽ được coi là ’’mức lo ngại’’.
Theo tài liệu của WHO, tháng 9/2008 EU đã đưa ra giới hạn 2,5 mg melamine/kg
sản phẩm chứa sữa hoặc sản phẩm sữa có nguồn gốc từ Trung Quốc. Hong Kong đưa
ra giới hạn 1 mg melamine/kg sản phẩm sữa và thức ăn cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi,
phụ nữ có mang và phụ nữ đang nuôi con bằng sữa mẹ, giới hạn 2,5 mg/kg cho các sản
phẩm khác. New Zealand cũng đưa ra giới hạn tương tự Hong Kong.
5/12/2008, WHO quyết định đưa ra ngưỡng melamine trong thực phẩm.
Theo đó, mức hấp thụ hàng ngày có thể chịu được (TDI) là 0,2 mg melamine/
1 kg trọng lượng cơ thể. Như vậy một người nặng 50 kg có thể hấp thụ 10 mg
7


melamine mỗi ngày mà không nguy hại tới sức khỏe. Mức này thấp hơn các mức TDI
trước kia mà một số nước đặt ra.
12/12/2008 Bộ Y tế Việt Nam ban hành ngưỡng melamine tối đa là 1 mg/kg đối
với thực phẩm dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi và 2,5 mg/kg với các thực phẩm khác,
tương đương với một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Australia, New Zealand...
Bộ Y tế ban hành ngưỡng này giúp các doanh nghiệp ổn định sản xuất, người tiêu
dùng đỡ hoang mang nhưng đồng thời cũng khẳng định tuyệt đối cấm mọi hình thức
cố ý đưa melamine vào trong thực phẩm.
2.1.7. Có cách nào để nhận diện melamine hay không ?
Với tính ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong công nghiệp nên
các phương pháp định tính, định lượng melamine cũng như các dẫn chất của melamine
đã được sử dụng rộng rãi. Tuy vậy, việc phát triển các phương pháp dùng tìm dấu vết
và định lượng melamine trong thức ăn, trong mô của động vật được chú ý sau khi vụ
phát hiện thức ăn nhiễm melamine nhập từ Trung Quốc (tháng 3 năm 2007). Phương

học hữu cơ khắp thế giới đã dùng phép sắc ký khí – lỏng. Ngày nay, mỗi năm, tài liệu
về sắc ký có đến hàng nghìn công trình và còn lớn hơn về sự ứng dụng của phương
pháp này. Về mặt triển vọng, những công trình ban đầu của Martin và Synge là những
công trình có tính quyết định trong sự phát triển của sắc ký phân bố và vào năm 1954
họ đã được nhận giải thưởng nobel về hóa học (Hồ Viết Quý, 2006).
2.2.2. Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp vật lý để phân tách, phân li, phân tích các chất dựa
vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Có nhiều nguyên
nhân đưa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp
lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động
qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.
Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả
của từng phương pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh.

9


Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha
động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ thống
sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất
khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha động
chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi
lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha
này. Nhờ vậy mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký (Archer J.P.
Martin, 1952).

Tướng động

Tách

Sắc ký lỏng

đảo),
Trao đổi ion, Rây phân tử.
Hấp phụ, Phân bố (pha thuận, pha

Lỏng

Lỏng

Sắc ký lỏng

đảo),
Trao đổi ion, Rây phân tử

Rắn

Khí

Sắc ký khí

Hấp phụ, Phân bố, Rây phân tử.

Lỏng

Khí

Sắc ký khí

Hấp phụ, Phân bố, Rây phân tử.

Hệ thống
bơm mẫu

Cột

Chuẩn bị
mẫu
Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC.

12

Detector

Hệ thống xử
lý dữ liệu


HPLC-UV có thể cung cấp thông tin định lượng (thường sử dụng UV ở bước
sóng 240 nm). Mẫu được chiết với hỗn hợp acetonitrile/H2O và được phân tích bởi sắc
ký lỏng ghép cặp ion (ion-pair HPLC). Chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm
lượng melamine tương đối lớn (WHO/HSE-FOS, 2 October 08).
2.3.2. Sắc ký lỏng ghép khối phổ
LC-MS-MS là phương pháp đáng tin cậy nhất dùng trong định lượng melamine
với nồng độ thấp trong nhiều loại mẫu phân tích. Nó cho độ nhạy và độ chọn lọc cao
trong phạm vi rộng các sản phẩm khác nhau. Mẫu được chiết với hỗn hợp
acetonitrile/H2O. Chất chiết được làm sạch với methylene chloride bằng cột SPE.
Melamine được tách ra từ cột SPE với hỗn hợp ammonium hydroxide/methanol, làm
khô, được tái tạo lại với chất nội chuẩn và hỗn hợp acetonitrile/H2O, đem phân tích
trên hệ thống LC-MS-MS. Yêu cầu sự trang bị máy móc phức tạp, thông qua sử dụng
chất đồng vị đánh dấu những tiêu chuẩn định lượng đáng tin cậy ở nồng độ thấp đến