1

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài thực tập tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, góp ý,
và giúp đỡ của quý thầy cô phòng Công nghệ sinh học Vật liệu và Nano, trung tâm
Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh và các thầy cô chuyên ngành Công
nghiệp, khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã
tạo điều kiện cho em thực tập tốt nhất.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô phòng Công Nghệ Sinh Học
Vật Liệu và Nano, trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình
dạy bảo em trong thời gian qua.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Lê Quang Luân đã dành thời gian
và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp đỡ em hoàn thành đề tài.
Em xin cảm ơn ThS. Đặng Hoàng Việt cùng các anh chị nhân viên phòng phòng
Công Nghệ Sinh Học Vật Liệu và Nano, trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ
Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình, những người
đã luôn bên cạnh và cổ vũ tinh thần lớn lao và ủng hộ em trong suốt thời gian vừa qua.
Mặc dù đã rất cố gắng thực hiện đề tài bằng sự tâm huyết và năng lực của mình, em
cũng không thể tránh khỏi những sai sót, rất mong nhận được sự đóng góp của thầy cô
và các bạn.
Kính chúc tất cả quý thầy cô và các bạn thành công trong công việc và cuộc sống.
Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 7 năm 2017
Sinh viên
Lại Thị Kiều Trang


2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i


4.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc...........................................................................7
4.2

Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano bạc...........................................................7

4.3

Giới thiệu về hạt nano bạc.............................................................................9

4.3.1

Định nghĩa...............................................................................................9

4.3.2

Các phương pháp phân tích hạt nano bạc................................................9

4.3.2.1 Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua:.............................................9
4.3.2.2 Phân tích phổ UV – VIS....................................................................10
4.4.3 Ứng dụng của hạt nano bạc........................................................................11
5. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus...........................................................11


3

5.1

Đặc điểm......................................................................................................11



Môi trường peptone kiềm:.....................................................................16

2.4.2

Môi trường TCBS:................................................................................16

3. Phương pháp thực hiện.......................................................................................16
3.1

Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức xạ
16

3.1.1
Ag+

Xác định liều chiếu xạ bão hòa của dung dịch Ag+/PVA theo nồng độ
16

3.1.2

Xác định các đặc trưng..........................................................................17

3.1.2.1 Đo phổ UV-vis dung dịch keo bạc.........................................................17
3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA
trong điều kiện in vitro...........................................................................................17
3.1.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát
triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus điều kiện in vitro..................................17
3.1.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nano bạc lên sự
phát triển của vi khuẩn V. Parahaemolyticus......................................................18

Bệnh gan tụy cấp tính

Ag+

Bạc ion

Ag0

Bạc nguyên tử

AgNPs

Bạc nano

AgNPS/PVA

Bạc nano sử dụng PVA làm chất ổn định

BHI

Brain – Heart Infusion

Co – 60

Đồng vị Cobalt 60

e-aq

Electron bị solvate hóa




7

DANH MỤC CÁC HÌ
Hình 1.1: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn..................................................................7
Hình 1. 2: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn.............................8
Hình 1. 3: Ion bạc liên kết với các base của DNA..........................................................8
Hình 1 .4: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học.........................9
Hình 1 .5: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm......................................10
Hình 1 .6: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc..............................................................10
Hình 1 .7: vi khuẩn V. parahaemolyticus......................................................................11
Hình 1 .8: dấu hiệu bệnh lý của tôm bị bệnh nhiễm khuẩn...........................................12
Y

Hình 2.2: Quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ quy
mô lớn.......................................................................................................................... 20
Hình 3. 1: Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của dung dịch keo bạc nano ở nồng độ
10mM Ag+...................................................................................................................22
Hình 3. 2: Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của dung dịch keo bạc nano ở nồng độ
5mM, 20 mM Ag+.........................................................................................................23
Hình 3. 3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA lên sự phát triển của
vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng...................................................24
Hình 3. 4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA lên sự phát triển của
vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường rắn.....................................................24
Hình 3. 5: Hiệu suất kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên môi trường rắn và lỏng
có bổ sung nano bạc ở các nồng độ khác nhau.............................................................25
Hình 3.6: kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước bạc lên sự phát triển của vi khuẩn
V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng..................................................................26
Hình 3. 7: kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước bạc lên sự phát triển của vi

Việt Nam có lợi thế cạnh tranh trên thế giới; kim ngạch tôm đạt trên 3,1 tỷ USD
[25]. Tuy nhiên, ngành thủy sản vẫn còn nhiều khó khăn và thách thức do dễ dàng
bị các dịch bệnh tấn công và phát triển gây thiệt hại nặng nề như là bệnh gan tụy
cấp tính (AHPNS) ở tôm do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bệnh ước tính có thể
gây thiệt hại cho ngành nuôi tôm lên đến 1 tỷ USD. Hiện nay, phương pháp đang
được sử dụng phổ biến để điều trị chống các loại vi khuẩn này là kháng sinh nhưng
trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh không mang lại hiệu quả hay
thậm chí còn làm tăng thêm mầm bệnh [26]. Báo cáo của Ven. L cho thấy V.
parahaemolyticus đã kháng lại hầu hết kháng sinh như imipenem, ampicillin,
chloramphenicol, gentamicin, tetracycline và một số kháng sinh khác [23]. Hơn nữa
việc tồn đọng dư lượng kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng xấu đến sức
khỏe con người [27].
Trước tình hình đó, ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ
nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano mà vẫn giữ nguyên được
tính chất và khả năng kháng khuẩn của bạc ion. Điều này làm tăng đáng kể số ứng
dụng của bạc. Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà
không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường. Chính vì vậy, giới khoa học
đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là khi
hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay.
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài thực tập: “Chế tạo chế phẩm
nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ và thử nghiệm hoạt tính kháng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm”.


3

Mục tiêu đề tài:
- Chế tạo thành công chế phẩm bạc nano/PVA bằng phương pháp chiếu xạ
- Khảo sát khả năng tiêu diệt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong điều
kiện in vitro của chế phẩm.

1.2.2 Phân loại
Có nhiều cách để phân loại vật liệu nano, một số cách phân loại thường dùng:
-

Phân loại theo hình dáng vật liệu:

Người ta đặt tên số chiều không bị giới hạn ở kích thước nano


5

+ Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám nano,
hạt nano
+ Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví dụ
dây nano, ống nano
+ Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví dụ
màng mỏng
+ Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một
phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một
chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
-

Phân loại theo tính chất vật liệu:

+ Vật liệu nano kim loại
+ Vật liệu nano bán dẫn
+ Vật liệu nano từ tính
+ Vật liệu nano sinh học [25]
2. Công nghệ chiếu xạ tạo hạt bạc nano
Nghiên cứu ứng dụng bức xạ để tổng hợp hạt nano kim loại phân tán trong

4. Hạt nano bạc
4.1 Giới thiệu về bạc kim loại
Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1
Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm
Bán kính ion bạc: 0,23 nm
Bảng 1. 1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [2]
Kích thước của hạt

Số nguyên tử chứa

nano Ag (nm)
1
5
20

trong đó
31
3900
250000

4.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc


7

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và
nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể
hiện tính độc với con người.
Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ
đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta


Hình 1. 3: Ion bạc liên kết với các base của DNA [11]

4.3 Giới thiệu về hạt nano bạc


9

4.3.1 Định nghĩa
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích
bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu
khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.
Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này
tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với
các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.
4.3.2

Các phương pháp phân tích hạt nano bạc

4.3.2.1Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua:
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu
kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên
có bước sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho
thấu kính quang học.
Ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép ta quan sát được hình dạng
và xác định được kích thước của các hạt nano.

Hình 1 .4: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học [16]



Hình 1 .7: vi khuẩn V. parahaemolyticus [28]

Ngành Proteobacteria.
Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram âm, hình que hơi cong, ngắn, di
động. Là vi khuẩn kỵ khí tùy ý có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên
men D-mannitol, maltose, L. arabinose, không lên men saccharose.

V.

parahaemolyticus là vi khuẩn ưa mặn (halophile) tồn tại trong nước biển và các
động vật biển như cá, tôm, sò, ốc, v.v.
Vibrio parahaemolyticus phát triển tối ưu ở nồng độ muối 3% NaCl nhưng có
thể phát triển ở nồng độ muối từ 0.5% - 8%. Nhiệt độ giới hạn là 5 – 43 oC trong đó
tối ưu ở 37oC. pH tối ưu là 7.5 – 8.5. Trong điều kiện thuận lợi, chúng sinh trưởng
rất nhanh, thời gian thế hệ ngắn, khoảng 11 phút.
5.2 Đặc điểm gây bệnh
V. parahaemolyticus có thể gây ra nhiễm trùng vết thương và nhiễm trùng huyết
ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua vết thương tiếp xúc với
động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển, đặc biệt là ở Đông Nam Á.Tuy
nhiên, không phải chủng V. parahaemolyticus nào cũng gây bệnh do chúng


12

mang các gen độc tố khác nhau. Trong số đó, hemolysin là loại độc tố phổ
biến nhất ở các loài Vibrio gây bệnh. Đây là ngoại độc tố bền nhiệt làm phân
giải tế bào hồng cầu và giải phóng hemoglobin. Ở loài V. parahaemolyticus, có ba
gen độc tố hemolysin chính bao gồm tdh và trh mã hóa các hemolysin bền nhiệt và
tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt [5].
Ngoài ra, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus còn có khả năng gây bệnh hoại tử

Theo nhận định của nhiều chuyên gia, công nghệ nano sẽ tạo nên một cuộc
cách mạng đột phá trong nhiều ngành khoa học và đời sống, tạo tiền đề cho một
“thế giới nhỏ hơn và thông minh hơn”.
6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam trong những năm gần đây công nghệ nano bắt đầu được đầu tư và
thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. Tuy nhiên cho đến nay số lượng công trình
nghiên cứu về kim loại nano được công bố trên tạp trí khoa học trong nước còn rất
hạn chế. Đề tài nghiên cứu về vàng và platin nano để xúc tác chuyển hóa CO thành
CO2 được tác giả Nguyễn Thiết Dũng Viện khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện khoa
học và công nghệ Việt Nam thực hiện (2009 – 2010). Về bạc, nhóm tác giả Nguyễn
Đức Nghĩa, Hoàng Mai Hà công bố trên Tạp chí hóa học (2001) đã chế tạo được hạt
nano bạc bằng phương pháp khử các ion bạc sử dụng tác nhân oleate trong polyme
ổn định, thu được các hạt bạc có kích thước từ 4 – 7nm.


14

Các nhà khoa học Việt Nam cũng bắt đầu triển khai ứng dụng công nghệ nano
trong chế tạo thuốc hướng đích và kết hoạch nghiên cứu ứng dụng của các hạt nano
trong y - sinh học để chẩn đoán và chữa bệnh. Bài báo “chế tạo và ứng dụng hạt
nano từ tính trong y sinh học” của nhóm tác giả Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoài
Hà, Trần Mậu Danh Bộ môn Vật liệu và Linh kiện từ tính nano, khoa Vật lý kỹ
thuật và Công nghệ nano, trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội và
Trung tâm Khoa học Vật liệu, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia
Hà Nội báo cáo tại hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI (2005). Tuy nhiên, công
nghệ nano vẫn là một điều gì đó mới lạ ở Việt Nam. Nói chung, công nghệ nano tại
Việt Nam hiện chỉ mới đang đặt những viên gạch móng đầu tiên [10].


15



2.3 Hóa chất
- Dung dịch keo bạc AgNPs/PVA được chiếu xạ với các nồng độ và liều xạ bão
hòa khác nhau là 5 mM và 20 mM
AgNO3
NaOH 1M
PVA
Nước khử ion
Pepton
NaCl

2.4 Môi trường sử dụng
2.4.1 Môi trường peptone kiềm:

Thành phần môi trường:
Peptone
10 g
NaCl
20 g
Nước cất
đủ 1000 ml
Dùng NaOH chuẩn pH về 8.6 ± 0.2, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút
2.4.2 Môi trường TCBS:
Cân vô trùng 88g môi trường TCBS vào 1L nước cất đã được hấp khử trùng ở
121oC, 15 phút. Đun nóng cho tan hết agar, để nguội đến 50 – 60 oC và tiến hành đổ
đĩa.
3. Phương pháp thực hiện
3.1 Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức
xạ

3.1.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát
triển của vi 1khuẩn V. parahaemolyticus điều kiện in vitro
Dung dịch sử dụng là dung dịch keo bạc nano nồng độ 10 mM được chiếu xạ ở
liều bão hòa theo nội dung 1. Thí nghiệm được bố trí làm 4 lô và được lặp lại ba lần
theo mô hình khối ngẫu nhiên theo sơ đồ như sau:
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA đến sự phát triển
của vi khuẩn V. parahaemolyticus
Nghiệm thức
Đối chứng
ND 5
ND 10
ND 15

Nồng độ bạc nano (ppm)
0
5
10
15