TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======
NGUYỄN THỊ DINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
HẤP THỤ THUỐC CAPTOPRIL
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

ThS. HÀ THỊ MINH TÂM

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Hà Thị Minh Tâm đã hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành
tốt khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2,
khoa Sinh- KTNN, Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2, cùng các thầy
cô trong tổ bộ môn Động vật, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, quan tâm động viên của bạn bè,
gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
SINH VIÊN

Nồng độ

E. coli

Escherichia coli

h

Giờ

OD

Optical Density

HS

Môi trường chuẩn Hestrin –
Schramm

g

Gam


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ...................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 14
3.1. Phổ hấp thụ và đường chuẩn của thuốc CAP ..................................................... 14
3.2. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường chuẩn .................................. 16
3.3. Thu màng VCK thô từ môi trường chuẩn .......................................................... 18
3.4. Tinh chế màng CVK .......................................................................................... 19
3.5. Màng CVK hấp thụ thuốc CAP ......................................................................... 21
3.6. Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK ....................................................... 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 25
1. Kết luận ................................................................................................................. 25
2. Kiến nghị ............................................................................................................... 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 26
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn ............................................................. 6
Bảng 2.1. Các trường hợp thí nghiệm ....................................................................... 12
Bảng 3.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc CAP .............................................. 14
Bảng 3.2. Mật độ quang của dung dịch CAP ở các nồng độ khác nhau (n=3). ........ 15
Bảng 3.3. Giá trị OD trung bình của dung dịch CAP sau khi ngâm màng CVK 120
phút (n=3) .................................................................................................................. 22
Bảng 3.4. Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK (n=3) .................................... 22


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Phổ hấp thụ cực đại của CAP với dung môi là nước cất .......................... 14
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung môi là nước cất ................... 15
Hình 3.3. Màng CVK sau 5 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trường chuẩn ................. 16
Hình 3.4. Màng CVK có độ dày 0,5cm sau 7 ngày nuôi cấy.................................... 17
Hình 3.5. Màng CVK có độ dày 1cm sau 14 ngày nuôi cấy..................................... 17

trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt như: Khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học. Trong đó đáng chú ý là cellulose,
đây là vật liệu vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [16].
Cellulose vi khuẩn (Viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi
khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng CVK có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật. Màng CVK có nhiều đặc tính vật lí,
1


hoá học ưu việt hơn so với cellulose thực vật như: độ bền cơ học cao, khả
năng thấm hút nước cao, cấu trúc từ những sợi nhỏ rất tinh vi, có độ tinh khiết
cao và khả năng polymer hoá lớn,… [7]. Vì vậy, màng CVK được ứng dụng
khá nhiều trong thực tiễn ở các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, y học, mỹ
phẩm,... đặc biệt trong lĩnh vực y tế nhờ khả năng kháng khuẩn cao [5]. Ngoài
ra, màng CVK cho thấy khả năng ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển
thuốc, được dùng qua đường uống, thẩm thấu qua da, và một số ứng dụng y
sinh học khác [6,8], đáng chú ý nhất là trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển thuốc.
Vì vậy, dựa trên khả năng ứng dụng của màng CVK trong tương lai có
thể tạo ra hệ thống tăng cường khả năng hấp thụ thuốc captopril, từ đó có thể
cải thiện một số hạn chế của thuốc trong quá trình sử dụng, giúp tăng hiệu quả
chữa trị. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ
thuốc captopril của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường
chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng CVK lên men từ
môi trường chuẩn HS.
- Nghiên cứu hệ thống CVK được hấp thụ thuốc captopril ở độ dày
màng khác nhau từ đó nhằm tìm ra trường hợp khả năng hấp thụ thuốc
captopril tối đa vào màng CVK.

captopril .
+ Từ hệ thống màng CVK đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ thuốc
tốt nhất.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về CVK
Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là đại diện cho
các polymer ngoại bào của vi sinh vật. CVK là sản phẩm của một số loài vi
khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (AJ Brown, 1986). Điều kiện
nuôi cấy có khả năng quyết định cấu trúc của màng CVK [15].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
Màng CVK được tổng hợp từ một số chi vi khuẩn phổ biến như
Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaliganes, Azotobacter,
Escherichia, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina và
Zoogloae, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum [2]. Đây cũng là loài vi
khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất. A. xylinum cũng là chủng vi
khuẩn được tập trung nghiên cứu nhiều nhất trong tổng hợp màng CVK.
Chúng có dạng hình que, thẳng hay hơi cong. Vi khuẩn A. xylinum là vi
khuẩn không sinh bào tử, thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không di động, sắp
xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi. Chúng là một trong những loài tiến hóa
nhất của nhóm vi khuẩn tía [18]. Mỗi tế bào A. xylinum có thể tổng hợp được
lượng cellulose là rất lớn nhờ khả năng chuyển hóa đến 108 phân tử glucose
và cellulose trong 1 giờ. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.
Chúng phát triển ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí
nên có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [6].
1.1.2. Cấu trúc và đặc điểm của màng CVK

(2S)-1-[92S)-2-methyl-3-sulphanyl-propanoyl]

pyrolidin-2-carboxylic; phải chứa từ 98,0% đến 101,5% C9H15NO3S; tính
theo chế phẩm đã làm khô. Thuốc ở dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng,
dễ tan trong nước, trong dicloromethan và methanol, tan trong các dung dịch
loãng của hydroxid kim loại kiềm. Về định tính thì phổ hấp thụ hồng ngoại
chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của captopril chuẩn.
1.2.2. Dược tính
Captopril là chất ức chế men chuyển angiotensin thông qua ức chế hệ
renin - angiotensin - aldosteron. Captopril được hấp thu tốt qua đường uống,
đạt sinh khả dụng khoảng 65%, nồng độ đỉnh trong máu của thuốc đạt được
5


sau khi uống thuốc 1h, duy trì tác dụng 6-8h. Thức ăn làm giảm hấp thu
thuốc. Thuốc có các tác dụng dược lý như: Chống tăng huyết áp, điều trị suy
tim, và sau nhồi máu cơ tim [10,14].
1.2.3. Tác dụng không mong muốn
Trong quá trình dùng thuốc thường gặp một số tác dụng phụ như: Hạ
huyết áp, ho, suy thận cấp, dị ứng, phù mạch thần kinh do thoát nước ra ngoài
mao mạch, thay đổi vị giác, viêm tuỵ, viêm lưỡi, thiếu máu, bệnh vàng da,…
1.3. Môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS)
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường chuẩn là môi trường Hestrin –
Schramm (HS) bao gồm thành phần được thể hiện trong bảng 1.1 (Schramm
et al, 1954) [15]:
Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn
D– glucose

20g




trong đó có 9 nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, hai nghiên cứu với thể
chất biến đổi màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite.
Trên thế giới, CVK đã được xem là nguồn nguyên liệu mới có khả năng
có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong thực tế như: Công
nhiệp thực phẩm, sử dụng để phân tách cho quá trình xử lí nước, được dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào [3,13]. Trong
lĩnh vực y học, màng CVK đã được nghiên cứu và ứng dụng làm màng điều
trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, mặt nạ dưỡng da,... Đặc biệt CVK
còn được sử dụng để làm vật liệu vận tải và chất bọc ngoài thuốc được sử
dụng ngoài da như caffeine, diclofenac,... Màng CVK đã cho thấy những hiệu
quả rõ rệt, khắc phục được một số hạn chế của thuốc ở dạng thông thường.
- Tại Việt Nam: CVK cũng đã được nghiên cứu tạo màng trị bỏng
[3,18], cố định bạc nano làm màng lọc nước uống nhiễm khuẩn [11].
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, và kết
quả cho thấy triển vọng của màng CVK trong ứng dụng làm màng trị bỏng
[3].
1.4.2. Captopril
- Trên thế giới: Cho đến nay tuy có sự xuất hiện của nhiều thuốc cùng
nhóm nhưng thuốc captopril vẫn luôn được lựa chọn trong lâm sàng. Theo
bản báo cáo thứ 5 của Uỷ ban liên kết quốc gia (Joint National Committee)
của Mỹ, khuyên nên sử dụng Captopril, Nifedipine, Clonidine và Labetalol
trong điều trị cấp cứu cho bệnh nhân cao huyết áp. Tới nay, trên thế giới đã có
nhiều công trình nghiên cứu về thuốc captopril. Trong đó, phải kể đến công
trình nghiên cứu của tiến sĩ Samir Attoub, Khoa Dược, Khoa Y học và Sức
khoẻ, Đại học UAE với công trình “Captopril như một chất ức chế tiềm năng
7

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Trang thiết bị: Máy đo quang phổ UV- Vis 2450 (Shimadru - Nhật
Bản); Nồi hấp khử trùng (HV-110/HIRAIAMA – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius - Thuỵ Sỹ); Bể rửa siêu âm (Thuỵ Sỹ); Buồng cấy vô trùng
(Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Brinder - Đức); Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA Đức); Máy nước cất hai lần (Anh); Tủ lạnh bảo quản mẫu (Ý).
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum trong môi trường chuẩn.
- Thu sản phẩm là màng CVK từ môi trường nuôi cấy và quá trình xử
lý.
- Chế tạo màng CVK nạp thuốc CAP.
- Khảo sát khả năng hấp thụ của thuốc CAP vào màng CVK.

9


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Captopril
- A. xylinum được nuôi cấy để tạo màng CVK trong môi trường chuẩn
HS
Nguyên liệu cao nấm men thêm các chất dinh dưỡng cần thiết để tạo
màng. Sau đó hấp tiệt trùng ở 1130C trong 15 phút. Khử trùng bằng tia cực
tím trong 15 phút. Sau đó để nguội rồi bổ sung dịch giống và acid acetic theo
tỷ lệ.
- Sau khi nuôi cấy tĩnh trong 6 – 14 ngày ở 26℃, ta thu được màng
CVK thô. Màng CVK sau đó được tinh chế bằng cách: Cho màng CVK thô
vào dung dịch NaOH 3M, đem đi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Sau đó
mang xả nước đến khi pH trung tính.
2.3.2. Thử độ sạch của màng
2.3.2.1. Kiểm tra glucose

190nm đến 250nm bằng cách sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta
thu được phổ hấp thụ cực đại của thuốc CAP.
- Nguyên tắc xây dựng đường chuẩn CAP:
Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 để xác định lượng CAP. Đo
các mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 200nm.
+ Pha thuốc CAP với dung môi là nước cất ở các nồng độ là: 10%,
20%, 40%, 60%, 80%, 100%.
+ Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – Vis 2450 để đo mật độ quang
của các dung dịch đã pha ở bước sóng 200nm trong các dung dịch mẫu chuẩn.
+ Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn bằng phần mềm
Excel 2010.

11


+ Để kết quả đo có độ chính xác cao ta tiền hành đo dung dịch chuẩn ba
lần và đo quang phổ ba lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
2.3.3. Phương pháp tạo màng CVK nạp thuốc CAP
Captopril được nạp vào vật liệu CVK theo phương pháp hấp thụ: Vật
liệu CVK (Kích thước d1,5cm) sau khi được sản xuất và làm sạch được ngâm
trong 25ml dung dịch CAP bão hoà (75mg/ml), dung môi là nước, đặt ở điều
kiện tĩnh ở 2 trường hợp như bảng 2.3.
Bảng 2.1. Các trường hợp thí nghiệm
Trường hợp

Độ dày màng (cm)

Điều kiện load thuốc vào màng

1

Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình. Số liệu thí
nghiệm thu được khi xác định hiệu suất nạp thuốc được phân tích trên phần
mềm Microsofl Excel, các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số
trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng được dùng để tính giá trị trung
bình của các lần lặp lại thí nghiệm. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa
thống kê khi giá trị p < 0,05.

13


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phổ hấp thụ và đường chuẩn của thuốc CAP
- Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta thu được phổ hấp thụ
cực đại của thuốc CAP được thể hiện như bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc CAP
Nồng độ

Bước sóng (nm)

OD

25mg/900ml

200

1,081

Abs.

Mật độ quang (OD)


0,2

0,4

0,6

0,8

1

độ
(mg/
ml)
0,113

OD

0,226

± 0,0013 ± 0,0015

0,458

0,665

± 0.0019 ± 0,0021

0,889



0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Nồng độ CAP (mg/ml)
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung môi là nước cất

15


- Phương trình đường chuẩn:
y = 1,0804x + 0,0136 (R² = 0,9992)
Trong đó: x - Nồng độ CAP (µg/ml).
y - Giá trị OD tương ứng.
R2 là hệ số tương quan.
3.2. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường chuẩn
Nuôi cấy tĩnh vi khuẩn A. xylinum, lúc này môi trường có đầy đủ chất
dinh dưỡng nên tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Ngày