BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ VÀ TÁC DỤNG
KHÁNG UNG THƯ CỦA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG
NIMOTUZUMAB GẮN 131I TRÊN CHUỘT
MANG KHỐI UNG THƯ ĐẦU CỔ NGƯỜI
Chuyên ngành : KHOA HỌC Y SINH
Mã số
: 9720101

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phạm Huy Quyến
PGS.TS. Hồ Anh Sơn

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Văn Ba
Phản biện 2: GS.TS. Văn Đình Hoa
Phản biện 3: PGS.TS. Lê Ngọc Hà

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp

các nhà khoa học đã ứng dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (gắn các
đồng vị phóng xạ với kháng thể đơn dòng), và như vậy tế bào ung
thư bị tiêu diệt bởi cơ chế kép: kháng thể kháng lại nó và bức xạ ion
hóa do đồng vị phóng xạ phát ra. Kháng thể đơn dòng Nimotuzumab
ức chế tế bào ung thư bằng cách chống tăng sinh mạch, chống phân
bào.

131

I là đồng vị phóng xạ có khả năng bức xạ ion hóa gây tổn

thương không hồi phục và bẻ gãy AND trong nhân tế bào. Kết hợp
131

I với Nimotuzumab sẽ làm tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư
Mục tiêu của đề tài:
1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô vảy đầu

cổ người dòng Hep-2 của phức hợp 131I-nimotuzumab in vitro.
2. Đánh giá sự phân bố và tác dụng kháng ung thư của phức
hợp

131

I-nimotuzumab trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung

thư biểu mô vảy đầu cổ người dòng Hep-2.


2

- 26 bảng, 8 biểu đồ, 22 hình
- 108 tài liệu tham khảo: + 04 tài liệu tiếng Việt
+ 104 tài liệu tiếng Anh


3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tình hình ung thư đầu cổ
Ung thư đầu cổ là một trong số những loại ung thư phổ biến
trên thế giới với ước tính khoảng 686.328 trường hợp năm 2012, bao
gồm 300.373 trường hợp ung thư ở môi và khoang miệng, 156.877 ở
thanh quản, 142.387 ở họng và 86.691 ung thư ở hầu mũi. Tỉ lệ mắc
từng loại ung thư ở vùng đầu cổ khác nhau tùy thuộc vào vùng địa lý,
và các mức độ tiếp xúc khác nhau với sự đa dạng các yếu tố nguy cơ.
Ở Việt Nam bệnh thường gặp nhiều ở nam (80%) thường vào
lứa tuổi 40-60 tuổi nhưng xu hướng hiện nay tỉ lệ người trẻ mắc bệnh
ngày càng tăng gây ra nhiều thiệt hại cho cộng đồng và cho xã hội và
là gánh nặng cho bệnh nhân cũng như nền y tế nói chung.
1.2. Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì trong ung thư biểu mô tế
bào vảy đầu cổ
Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) đặc biệt quan
trọng trong bệnh sinh của ung thư biểu mô vảy đầu cổ. Hơn 90% các
trường hợp ung thư đầu cổ có biểu hiện quá mức EGFR. Sự biểu
hiện quá mức của EGFR và phối tử của nó TGF-α (transforming
growth factor alpha) xuất hiện phổ biến trong HNSCC, sự xuất hiện
RNA thông tin (mRNA) của EGFR và TGF-α ở mức cao tương ứng
là 92% và 87% của các khối ung thư. Hơn nữa, sự biểu hiện EGFR
tăng cao tại các khối u ở giai đoạn tiến triển hoặc tại các khối u kém
biệt hóa, đồng thời cũng có sự tăng biểu hiện của EGFR ở những tế
bào biểu mô bình thường trong tổ chức liền kề với khối u. Điều này

trên vỏ điện tử: 2, 8, 18, 18, 7. Có 37 đồng vị của iod, trong đó chỉ có
duy nhất 127I là bền. Đồng vị phóng xạ 131I có chu kỳ bán rã khoảng 8
ngày.

131

I phân rã phát tia β và gama (γ), năng lượng phát tia γ cho

chụp hình để chẩn đoán của
để điều trị là 606 keV.

131

I là 364 keV, năng lượng phát ra tia β


5
1.3.3. Tác dụng 131I gắn với kháng thể đơn dòng trong điều trị ung
thư
Liệu pháp miễn dịch phóng xạ (Radioimmunotherapy -RIT)
sử dụng các kháng thể đơn dòng gắn với đồng vị phóng xạ nhằm xác
định vị trí khối ung thư và điều trị đích. Phức hợp miễn dịch phóng
xạ được tiêm vào tĩnh mạch hoặc tiêm trực tiếp vào khối u, vào các
khoang trong cơ thể như khoang màng bụng, màng phổi… Sau khi
được tiêm vào cơ thể phức hợp sẽ được phân phối theo dòng chảy
của máu, bằng khuếch tán hoặc đối lưu dẫn đến đích tự nhiên mang
dấu ấn, đó là các kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể đơn dòng trên
bề mặt của các tế bào khối u. Các bức xạ từ phức hợp miễn dịch
phóng xạ giết chết tế bào ung thư khi DNA của nó bị hư hỏng vượt
quá khả năng sửa chửa của chúng. Các đồng vị phóng xạ sử dụng để

- Chuột thiếu hụt miễn dịch BALB/c 6-8 tuần tuổi, khối lượng 1822g. Số lượng được sử dụng trong nghiên cứu là 63 chuột:
+ 33 con: đánh giá sự phân bố của

131

I-nimotuzumab trên

chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ.
+ 30 con: đánh giá tác dụng điều trị ung thư của

131

I-

nimotuzumab trên chuột mang khối ung thư biểu mô vảy đầu cổ.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y
- Trung tâm Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y
- Khoa Y học hạt nhân Bệnh viện 103 - HVQY
- Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện 103 - HVQY
- Phòng thí nghiệm trọng điểm Gen-Protein ĐHKHTN, Đại
học quốc gia Hà Nội.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp thực nghiệm,
tiến cứu, chọn thời điểm so sánh đánh giá trước, trong và sau điều trị.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 của phức hợp

131

+ Đánh giá phân bố của

131

I-nimotuzumab ở máu mô - cơ

quan: chuột mang khối ung thư được tiêm

131

I-nimotuzumab: sau 24,

48 và 72 giờ chuột được lấy máu, mô và các tạng đếm xung gama.
+ Đánh giá phân bố toàn thân của
chuột: chuột mang khối ung thư được tiêm

131

I-nimotuzumab trên

131

I-nimotuzumab: sau 24,

48 và 72 giờ chuột được chụp xạ hình SPECT.
- Đánh giá hiệu quả điều trị của

131

I-nimotuzumab: chuột mang khối

2.3.3.2. Đánh giá tác dụng gây chết tế bào theo chương trình
2.3.3.3. Kiểm tra hoạt tính của phức hợp

131

I-nimotuzumab tại các

thời điểm thực nghiệm.
2.3.3.4. Đánh giá phân bố của

131

I-nimotuzumab bằng phương

pháp đếm hoạt độ phóng xạ của mô và cơ quan chuột
2.3.3.5. Đánh giá sự phân bố của

131

I-nimotuzumab bằng phương

pháp chụp SPECT
2.4. Xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 21.0
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep-2 của Nimotuzumab và
131

I-nimotuzumab in vitro



94,07 ± 0,96

97,61 ± 1,30

25

94,32 ± 1,12

Tác dụng của Nimotuzumab và phức hợp

105,65 ± 1,08
131

I-Nimotuzumab với các

dải nồng độ 400µg/ml, 200µg/ml, 100µg/ml và 25 µg/ml trên các
giếng nuôi tế bào Hep-2 cho thấy ở nồng độ hóa chất càng cao thì số
lượng tế bào ung thư sống sót càng giảm.


9

Biểu đồ 3.1: Mối liên quan giữa mức độ ức chế tế bào Hep-2 (Y,%)
và nồng độ Nimotuzumab (X, µg/ml) sau 48 giờ
Liều ức chế 50% tế bào (IC 50) của Nimotuzumab trên dòng tế
bào Hep-2 sau 48 giờ là: IC50= (50 - 98.58)/(-0.082) = 0,004mmol/l

Biểu đồ 3.2: Mối liên quan giữa mức độ ức chế tế bào Hep-2 (Y,%)
và nồng độ 131I-Nimotuzumab (X, µg/ml) sau 48 giờ.


Máu (n = 6)

Số đếm/mg

221,83

1114,42

Trung vị

219,47

1065,07

p

0,002


12
Sau 24 giờ tiêm, phức hợp

131

I-nimotuzumab tập trung chủ yếu ở

máu, ở u thấp hơn, với p < 0,0001.
Bảng 3.3: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô
và cơ quan chuột tại thời điểm 24 giờ sau tiêm


204,65

190,84

p1,4 = 0,394

Tuyến giáp (5)

189,76

217,77

p1,5 = 0,394

Lách (6)

189,12

165,04

p1,6 = 0,180

Gan (7)

167,69

176,38

p1,7 = 0,240

350,32

852,70

343,04

866,43


13
p

0,002

Sau 48 giờ tiêm, phức hợp

131

I-nimotuzumab ở u tăng lên còn trong

máu giảm, tuy nhiên, trong u vẫn thấp hơn trong máu, với p < 0,05.
Bảng 3.5: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô
và cơ quan chuột sau 48 giờ
Hoạt độ
trung bình
U (số
đếm/mg)
(n = 6)

350,32 (1)

142,18

146,0

p1,4 = 0,002

Gan (5)

137,46

134,07

p1,5 = 0,002

Tuyến giáp (6)

137,22

135,06

p1,6 = 0,002

Lách (7)

120,98

128,35

p1,7 = 0,002


U (n = 6)

Máu (n = 6)

253,63

320,01

208,34

358,0


14
p

0,24

Sau 72 giờ, phân bố

131

I-nimotuzumab ở u và máu gần tương đương

nhau, không có sự khác biệt với p > 0,05.
Bảng 3.7: So sánh phân bố 131I-nimotuzumab ở u so với các mô
và cơ quan chuột tại thời điểm 72 giờ sau tiêm
Hoạt độ
Hoạt độ
trung bình


Thận (5)

71,17

72,41

p1,5 = 0,002

Gan (6)

48,25

48,75

p1,6 = 0,002

Lách (7)

44,04

44,62

p1,7 = 0,002

Ruột (8)

34,87

31,69


72 giờ tiêm (%)

19,91
8,61
18,36
31,57
19,50
15,05

41,08
7,42
19,14
25,25
16,67
16,12

79,26
10,30
23,70
40,21
22,24
15,08


15
Ruột
Tuyến Giáp
Lách


* Thuật toán One way ANOVA
Bảng 3.10: So sánh hoạt độ phóng xạ bằng chụp SPECT tại vùng
đầu cổ và khối u của chuột sau 48 giờ tiêm 131I-nimotuzumab
Vị trí
Đầu cổ (n = 5)
U (n = 5)
Số đếm trung bình
2,16
4,55
SD
0,70
1,53
p
0,017
*Thuật toán One way ANOVA
Bảng 3.11: So sánh hoạt độ phóng xạ bằng chụp SPECT tại vùng
đầu cổ và khối u của chuột sau 72 giờ tiêm 131I-nimotuzumab
Vị trí
Đầu cổ (n = 5)
U (n = 5)
Số đếm trung bình
5,62
11,07


16
SD
p

2,84

hơn nhóm chứng; có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
3.3.2. Đánh giá khối lượng chuột thí nghiệm sau điều trị


17
Biểu đồ 3.7: Khối lượng chuột của các nhóm sau 8 tuần điều trị
Khối lượng trung bình của nhóm chuột được điều trị bằng

131

I-

nimotuzumab thấp hơn so với hai nhóm chuột còn lại, với p > 0,05.
3.3.3. Thời gian sống trung bình của các nhóm chuột điều trị
Bảng 3.24: Thời gian sống sót trung bình của các nhóm chuột
Nhóm chuột
điều trị

Thời gian
sống sót

%

Số chuột
sống

trung bình

NaCl 0,9%


* Sử dụng kiểm định LOG RANK
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Tác dụng kháng tế bào Hep-2 của 131I-Nimotuzumab in vitro
4.1.1. Khả năng ức chế tế bào Hep-2 qua thử nghiệm MTT
Với thử nghiệm MTT nhằm tính được nồng độ ức chế 50%
của Nimotuzumab đơn thuần và phức hợp

131

I-Nimotuzumab với tế

bào Hep-2. Kết quả cho thấy IC50 của Nimotuzumab và phức hợp 131INimotuzumab lần lượt là 0,004mmol/l và 0,0039mmol/l. Như vậy
khi kết hợp 131I với Nimotuzumab có xu hướng làm tăng khả năng ức
chế tế bào Hep-2 phát triển so với sử dụng Nimotuzumab đơn thuần.
Mặc dù sự khác biệt này chưa lớn và chưa có ý nghĩa thống kê,


18
nhưng cũng có thể thấy dấu hiệu tích cực trong tăng hiệu quả điều trị
ung thư khi có sự phối hợp hai yếu tố kể trên trong điều kiện in vitro.
4.1.2. Bước đầu xác định cơ chế gây chết tế bào Hep-2 theo con
đường apoptosis
Chúng tôi cũng tiến hành đánh giá khả năng gây chết tế bào
theo chương trình (apoptosis) của phức hợp

131

I-Nimotuzumab khi so

sánh với từng chất đơn lẻ và nhóm không dùng thuốc (nhóm chứng)


131

I-nimotuzumab trên chuột mang khối ung

thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ người dòng Hep-2
4.2.1. Phân bố sinh học 131I-Nimotuzumab trong các tạng chuột
Phân bố sinh học của phức hợp 131I-Nimotuzumab trên mô và
cơ quan và khối u được xác định bằng phương pháp đếm xung tia
gamma tại các thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau tiêm. Kết quả trên mô
và cơ quan ngoài khối u cho thấy

131

I- nimotuzumab phân bố cao

nhất trong máu, và gần như tương đương ở các mô và cơ quan khác,
thấp nhất ở cơ và có xu hướng giảm dần theo thời gian khảo sát.
Trong nghiên cứu này chúng tôi còn tiến hành khảo sát phân bố

131

I-

nimotuzumab ở mô và cơ quan của chuột thí nghiệm, cụ thể tỷ số
đếm xung tia gamma cao nhất ở thời điểm 48 giờ và duy trì ở mức


19
cao đến 72 giờ sau khi tiêm. Khi so sánh tỷ số đếm xung tia gamma

mang khối u). Trong đó sự khác biệt lớn nhất được thấy ở thời điểm
24 giờ, và duy trì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ít nhất là đến 72
giờ sau khi tiêm. Đến đây sẽ có câu hỏi đặt ra: phức hợp

131

I-

nimotuzumab tập trung trên bề mặt khối u hay vào sâu hơn trong
khối u. Vì nếu phức hợp này được đưa càng sâu trong khối u thì làm
cho số lượng tế bào ung thư sống sót càng giảm. Trên mỗi chuột có 2
vùng diện tích mỗi vùng khoảng 250 - 300 pixel: một vùng đặt tại vị
trí đầu cổ, một vùng là khối u chuột và máy xạ hình SPECT sẽ chụp
được trên bề mặt 2 vị trí này rồi dùng phần mềm tính mật độ trung
bình tập trung hoạt độ tia xạ. Vậy chụp xạ hình SPECT chỉ đo và tính
được được độ tập trung phóng xạ trên bề mặt của 2 vị trí này. Vì đã
biết ưu và nhược điểm của phương pháp này nên khi phẫu tích chuột


20
để đánh giá phân bố sinh học của phức hợp

131

I-Nimotuzumab trên

mô, cơ quan và khối u chuột, tôi không lấy cả khối u mà cắt lấy vị trí
trung tâm khối u để đưa vào ống eppendrof đếm hoạt độ tia gamma.
Kết quả cho thấy phức hợp



131

I-Nimotuzumab

chúng tôi tiến hành đo thể tích khối u của các nhóm chuột sau tiêm
liều duy nhất

131

I-Nimotuzumab, đồng thời có so sánh nhóm chuột

tiêm Nimotuzumab đơn thuần và nhóm chuột tiêm NaCl 0,9% (nhóm
chứng) ở các thời điểm khác nhau sau tiêm. Kết quả cho thấy ở thời
điểm một tuần khi tiêm, thể tích khối u giữa các nhóm chuột là tương
đương nhau và không có sự khác biệt, không có ý nghĩa thống kê.
Tuy nhiên đến tuần thứ hai sau khi tiêm, thể tích khối u ở nhóm
chuột được tiêm 131I-Nimotuzumab nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê (p


131

I-Nimotuzumab có thể tích trung bình

khối u nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng ở hầu hết các
thời điểm theo dõi cho đến tuần thứ tám (với p < 0,01 - 0,008). Tôi
không thấy có sự khác biệt, không có ý nghĩa thống kê giữa nhóm
131

I-Nimotuzumab với Nimotuzumab. Khi so sánh thể tích trung bình

khối u từ tuần đầu đến hết tuần năm giữa nhóm chuột điều trị
Nimotuzumab đơn thuần so với nhóm chứng không thấy có sự khác
biệt.
Mặc dù thể tích trung bình khối u đo được ở tất cả các nhóm
chuột thí nghiệm đều tăng hơn qua các thời điểm theo dõi, nhưng sự
tăng dần kích thước khối u ở các chuột thí nghiệm, thông qua đo thể
tích khối u ở các nhóm chuột, là không giống nhau khi so sánh tại
cùng một thời điểm. Ở các thời điểm tương ứng thì kết quả thể tích


22
trung bình khối u nhóm chuột điều trị 131I-Nimotuzumab đều nhỏ hơn
rõ rệt so với nhóm chứng (có ý nghĩa thống kê) và nhỏ hơn so với
nhóm điều trị chế phẩm Nimotuzumab đơn thuần. Điều này được thể
hiện rõ nhất thông qua biểu đồ biến đổi thể tích trung bình khối u ở
nhóm chuột chứng không điều trị (chỉ tiêm dung dịch NaCl 0,9%) từ
thể tích khối u trung bình của nhóm này ở ngày đầu theo dõi là 79,78
mm3 đã tăng lên 819,91 mm3 ở thời điểm sau 8 tuần theo dõi. Trong

trị bằng

131

I-Nimotuzumab là 0,9 cao hơn so với nhóm chứng, với tỉ

lệ sống sót là 0,5. Ngoài ra thời gian sống trung bình của nhóm chuột
điều trị bằng

131

I-nimotuzumab (110,8 ngày) cũng dài hơn so nhóm

chuột điều trị bằng Nimotuzumab đơn thuần (109,6 ngày).
Việc kết hợp

131

I và Nimotuzumab đã chứng minh được hiệu

quả bước đầu trong điều trị ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ người


23
trên mô hình động vật. Vậy phức hợp

131

I-Nimotuzumab đã được



131

I-

nimotuzumab trên chuột thí nghiệm
- Sự phân bố tốt của phức hợp 131I-nimotuzumab trên chuột:
+ Chế phẩm

131

I-Nimotuzumab có sự phân bố tương đối

đồng đều ở khối u và ở các mô, cơ quan khác trong cơ thể chuột 24
giờ sau tiêm. Chế phẩm sau đó tập trung ở khối u với hoạt độ trung
bình tăng dần ở thời điểm 48, 72 giờ sau tiêm và cao hơn nhiều so
với ở các mô, cơ quan khác trong cơ thể; bằng cách đếm xung tia
gamma, tỷ lệ % số đếm xung tia gamma tại khối u theo thời gian lần
lượt là 41,08%; 79,62% và cao hơn tỷ lệ tương ứng ở các cơ quan