ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU
(Aconitum carmichaelii Debx.)
Ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

THÁI NGUYÊN - 2018


bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi.
Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong luận
văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để luận văn
thêm hoàn thiện.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Loan

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................. 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu ............................................................................... 3
1.1.1. Phân loại cây Ô đầu ............................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam............................................ 3
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu .......................................................................................... 4
1.2. Phương pháp phân loại học phân tử ....................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA ................................................................................ 5

CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN .................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BOLD

:

The Barcode of Life Data System

BLAST

:

The Basic Local Alignment Search Tool

CIA

:

Chloroform : Isoamyl Alcohol Solution

CTAB

:


Internal Transcribed Spacer

Kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The

National

Center

for

Information
PCR


cây Ô đầu ............................................................................................. 27
Hình 3.9. Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn gen matK phân lập từ mẫu
Ô đầu ................................................................................................... 28
Hình 3.10. Trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Ô đầu Hà Giang và
của cây Ô đầu mang mã số KY407560 trên GenBanK....................... 29
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu
thuộc chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK. .... 30
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản vùng ITS từ
hệ gen cây Ô đầu ................................................................................. 31
Hình 3.13. Kết quả phân tích bằng BLAST đoạn DNA phân lập từ mẫu Ô
đầu Quản Bạ, Hà Giang....................................................................... 32
Hình 3.14. Trình tự nucleotide vùng ITS của mẫu Ô đầu Quản Bạ, Hà
Giang và của cây Ô đầu mang mã số KU041716 trên GenBanK ....... 32
Hình 3.15. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu
trong chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ........... 33

vi


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong
phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Trong đó, nhiều cây có giá trị làm thuốc
nhưng cũng có độc tính, được xếp trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc
như Thầu dầu, Cà độc dược, Ô đầu ... Vì vậy, khi sử dụng những loại dược liệu
này làm thuốc cần phải đặc biệt chú ý đến cách sử dụng, liều dùng, đối tượng
dùng và phải được chế biến theo quy trình nghiêm ngặt, đúng kỹ thuật để đảm
bảo an toàn cho người sử dụng.
Ô đầu, Phụ tử chứa những thành phần có độc tính cao nhưng vẫn được
cho là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong y dược học cổ

Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã bắt đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng
nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch
DNA quốc gia cho các loài sinh vật, góp phần phân loại, bảo tồn và phát triển
nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS ở cây Ô đầu
(Aconitum carmichaelii Debx.)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS từ cây Ô
đầu làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Ô đầu (Aconitum
carmichaelii Debx.) tại Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu
- Nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen matK/ITS từ cây Ô đầu ở
Việt Nam.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu
1.1.1. Phân loại cây Ô đầu
Aconitum carmichaelii Debx. có tên thường gọi là cây Ô đầu. Ngoài ra,
Ô đầu còn được gọi bằng các tên khác là Củ gấu tàu, Ấu tàu, Thảo ô, Xuyên ô.
Theo thống kê trong Danh mục dược liệu độc làm thuốc, cây Ô đầu ở Việt Nam
bao gồm có hai loài là: Aconitum fortunei Hemsl. và Aconitum carmichaelii
Debx. [16], [25]. Cây Ô đầu là một loại thực vật thân cỏ, có độ cao chừng
khoảng 0,6 – 1m, thân mọc thẳng đứng. Lá có hình mắt chim, xẻ 3 thùy, mép lá
hình răng cưa. Hoa có màu xanh tím và thành từng chùm. Quả chia thành 5 đại

Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là Aconitum carmichaelii Debx. Việc xác định
tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở các địa phương khác cũng chưa được thực

3


hiện. Do đó, cần có nghiên cứu định danh tên khoa học chính xác của cây Ô
đầu [3], [5].
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu
Trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alcaloid,
polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính. Trong các bộ
phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid
chính có trong củ Ô đầu. Ngoài ra, trong củ Ô đầu còn có tinh bột, đường,
manit, chất nhựa, các acid hữu cơ chất béo và sterol. Ở thân, lá và hoa cây Ô
đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [30].
Cây Ô đầu là loại dược liệu có tính độc cao [12], [21], [33]. Cây Ô đầu
chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất là ở củ [34]. Trong dược
thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ nhỏ.
Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu. Phụ tử có độc tính kém
hơn Ô đầu. Ô đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa,
gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên tim
mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14], [29].
Theo y học dân tộc, Ô đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng
trợ dương bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp. Trong đông y, Ô đầu được dùng để
chữa các chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại... Thường chỉ dùng làm
thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ
định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc. Tây y dùng làm thuốc ho và chữa
chứng ra mồ hôi nhiều [35], [36].
Hiện nay, trên thị trường đã có một số sản phẩm làm từ cây Ô đầu như:

thay đổi hình thái (các bộ phận của cây đã bị cắt thái, sấy khô…).
Hiện nay, trên thế giới phương pháp phân loại học phân tử để xác định
loài là hướng nghiên cứu đang phát triển mạnh, được xây dựng dựa trên việc
nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu ở sinh vật. Trong đó, kỹ
thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp đạt hiệu quả cao trong việc định
loại và giám định loài [32].

5


Năm 2003, Hebert P.D., nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đã đề xuất mã vạch DNA (DNA Barcode, chỉ thị DNA) giống như một
cách để xác định loài. Mã vạch DNA được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ
một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện
được các loài [20].
Một mã vạch DNA điển hình đảm bảo được các yêu cầu:
(1) Hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu.
(2) Có tính phổ biến.
(3) Có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời.
Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh
chóng xác định được sự khác biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách
chính xác [20], [28].
Mã vạch DNA là một đoạn gen ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã
được xác định nằm trong Ngân hàng gen, nó được sử dụng để định danh các
loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự DNA của Ngân
hàng gen (Genbank) [15], [19].
1.2.2. Phân loại thực vật học bằng mã vạch DNA
Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng và phong
phú, đặc biệt là nguồn cây dược liệu. Hệ thực vật rất đa dạng, gồm thực vật có
hạt (hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dương xỉ và các loài có quan hệ gần với

phương pháp phân tích DNA trong việc phân loại và giám định mẫu vật. Phân
tích DNA cụ thể là kỹ thuật mã vạch DNA đã xác định chính xác tên loài và
đánh giá có hiệu quả trong việc giám định loài [28], [32].
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA ở thực vật để xác
định một mã vạch DNA tiêu chuẩn đối với thực vật. Dựa trên các kết quả
nghiên cứu giám định loài thực vật mà đã thực hiện trên nhiều mẫu thực vật
khác nhau, có các đại diện cho thực vật hạt kín, thực vật hạt trần, các vùng gen
được lựa chọn như: gen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoB, gen rpoC1,
psbK-psbI và gen trnH-psbA. Dựa trên những đánh giá có khả năng thu được,

7


chất lượng và mức độ phân biệt giữa các loài, nhiều nghiên cứu đã đưa ra kết
luận gen có mức độ phân biệt loài cao đó là gen rbcL và matK [23].
Hiện nay, việc điều trị các bệnh khác nhau thì thuốc thảo dược được sử
dụng rộng rãi ngày càng nhiều, ngành công nghiệp dược liệu cũng phát triển.
Với nhiều lý do mà hiện nay các loại dược liệu có thể bị pha trộn làm giảm đi
hiệu quả của thuốc. Dược liệu bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính nên
một số trường hợp có thể thể gây nguy hiểm đến tính mạng. Các loại thuốc thảo
dược được sử dụng ngày càng tăng vì vậy xác định chính xác nguồn gốc của
các loại dược liệu là điều cần thiết. Li M. và cộng sự (2011) đã tiến hành
nghiên cứu xác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA [24]. He J và
cộng sự (2010) cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số
mẫu cây dược liệu trong chi Aconitum [19]. DNA là một đại phân tử ổn định và
được tìm thấy trong tất cả các mô. Do đó, sự phát triển của các dấu hiệu nhận
biết dựa trên DNA là rất quan trọng để xác định cây thuốc [27].
1.3.2. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc phân loại học phân tử các loài sinh vật nói chung và
thực vật nói riêng đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong thời

đàn rủ được xác định vào cùng một loài C. Tonkinensis [6].
Để góp phần xác định mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi
Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền
thống với phương pháp phân tích trình tự DNA của một gen mã vạch như ITS,
matK, trnK. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) đã khuếch đại thành công hai vùng
gen ITS và matK. Kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy
vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chiếm
17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK
kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình
tự và cây phát sinh chủng loại được xây dựng. Kết quả phân tích trình tự DNA
và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết luận vùng gen matK có khả
năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để
phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis [13], [40].

9


Bùi Thanh Tùng và cộng sự (2017) đã sử dụng phương pháp giải trình tự
DNA để xác định tên khoa học của cây Ô đầu của Việt Nam. Kết quả đã giải
được trình tự gen của cây Ô đầu và khi so sánh với trình tự gen của loài A.
carmichaelii Debx. thấy có sự tương đồng đến 99%. Đây là căn cứ khoa học để
xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: A. carmichaelii
Debx. họ Ranunculaceae [17].
Như vậy, việc sử dụng mã vạch DNA trong phân loại học đã và đang
được ứng dụng rộng rãi. Phương pháp này còn góp phần rút ngắn thời gian
trong phân loại và định danh loài mới của sinh vật. Hiện nay, mã vạch DNA
còn giúp các loài có cùng nguồn gốc bằng phân tích sự đa hình di truyền.
1.4. Sơ lược về gen matK và ITS
Gen maturase K (MatK) là gen mã hóa enzyme maturase, một protein kết
nối các intron. Gen matK là một trong số các gen trong lục lạp có mặt ở hầu hết

hai đoạn đệm sao chép nội bộ ITS1 và ITS 2 có mặt ở hai bên của vùng 5,8S
(Hình 1.2). Vùng này có thể dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR với các
mồi đặc hiệu. Về cấu trúc, vùng ITS gồm các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2
sắp xếp xen kẽ giữa với những trình tự mã hóa ribosome. Vùng mã hóa được
bảo tồn cao hơn vùng không mã hóa. [28], [31], [32].

18S rRNA

ITS1

5,8S rRNA

ITS2

28S rRNA

Hình 1.2. Cấu trúc vùng gen ITS
Hiện nay, ITS được coi là một trong những chỉ thị phân tử để xác định
phát sinh loài hữu ích nhất cho cả thực vật và động vật, bởi vì tính chất phổ
biến của ITS, sự thừa kế lưỡng cực và những thay đổi tiến hóa tương đối cao
hơn do các ràng buộc chức năng ít hơn. Một ưu điểm nữa là vùng ITS1 và ITS2
có thể được khuếch đại bằng phản ứng PCR một cách riêng biệt với các mồi đặ
hiệu cho từng vùng. Điều này tạo điều kiện dễ dàng khuếch đại ITS từ mẫu
DNA có chất lượng kém hoặc bị suy thoái. Ngoài ra các mồi khác có thể
khuếch đại cả hai vùng ITS1 và ITS2. Với các ưu thế như sự sẵn có của mồi, sự
hiện diện của nhiều bản sao trong tế bào, tính phổ quát cao và khả năng phân
biệt loài tốt, vùng ITS đã được xem như là một chỉ thị phân tử tiềm năng cho
mã vạch trong thực vật [20], [28], [32]. Vì vậy, vùng ITS được sử dụng để giám

11

Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS và gen matK được xác định tại
công ty 1st BASE tại Singapore.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
- Quan sát, mô tả, chụp ảnh về hình thái chung của cây Ô đầu
- Sử dụng phương pháp hình thái so sánh: căn cứ vào đặc điểm hình thái
đối chiếu mô tả trong tài liệu chuyên khảo để xác định tên loài.

13


2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá
* Sử dụng phương pháp cắt lát, phương pháp nhuộm kép để nghiên cứu
cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu.
+ Phương pháp cắt lát: Dùng dao lam cắt lát thật mỏng theo những
phương hướng nhất định trong không gian (theo mặt phẳng ngang, mặt phẳng
dọc hay tiếp tuyến). Chú ý cắt lát thật mỏng thẳng góc với trục của vật mẫu,
không nhay lại lát cắt, lát cắt phải đảm bảo vuông góc với trục thẳng của vật cắt.
+ Nhuộm lát cắt theo phương pháp nhuộm kép: tiến hành nhuộm kép với
thuốc nhuộm màu xanh metylen và cacmin. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Lát cắt được ngâm vào dung dịch nước javen trong 10 - 15 phút
để tẩy sạch nội chất của tế bào.
Bước 2: Rửa sạch javen bằng nước cất (2 - 3 lần).
Bước 3: Ngâm mẫu bằng axit axetic để sạch nước javen còn dính lại (nếu
không javen sẽ làm mất màu thuốc nhuộm).
Bước 4: Rửa sạch axit axetic bằng nước cất (rửa 2 lần)
Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch cacmin trong khoảng 30 phút.
Bước 6: Rửa qua mẫu bằng nước cất (2-3 lần).
Bước 7: Nhuộm mẫu bằng dung dịch xanh metylen trong khoảng 30 giây.
Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất (2-3).

- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan DNA trong 100 µl nước khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100
mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Bảo quản DNA tổng số ở -20oC.
* Phương pháp PCR
Khuếch đại vùng ITS và gen matK bằng PCR với các cặp mồi là: ITS-F/
ITS-R và matK-F/ matK-R. Trình tự nucleotide của các cặp mồi này được thể
hiện ở bảng 2.1.

15


Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi ITS-F/ITS-R
và cặp mồi matK-F/matK-R
Kích thước
Trình tự nucleotide 5’  3’

Cặp mồi

đoạn DNA
(bp) dự kiến

ITS-F

ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG

ITS-R

TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTACT


3

dNTP 10mM

0,4

4

Primer

0,8

5

Taq polymerase ( 1 UI/µl)

0,1

6

DNA khuôn

2

2

Tổng thể tích

20