MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề: .............................................................................................................. 1
1.2 Tình hình nghiên cứu: ............................................................................................. 2
1.3 Mục đích nghiên cứu: ............................................................................................. 4
1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu:............................................................................................. 4
1.5 Phương pháp nghiên cứu: ....................................................................................... 4
1.6 Các kết quả đạt được của đề tài: ............................................................................. 5
1.7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp: ................................................................................. 5
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 6
2.1. Nấm Linh chi ......................................................................................................... 6
2.1.1. Khái quát chung [1, 2, 8, 10] .......................................................................... 6
2.1.2. Vị trí phân loại ................................................................................................ 6
2.1.3. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi đen ......................... 7
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ....... 7
2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của sợi nấm [3, 13] ................................................ 9
2.1.4. Điều kiện sống của nấm linh chi. ................................................................. 10
2.1.4.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm. ..................... 10
2.1.4.2 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm. .................. 11

i


2.1.5 Các nghiên cứu về nấm linh chi đen: ............................................................. 13
2.2. Nguyên liệu trồng nấm ........................................................................................ 14
2.3

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................... 16

ii


3.2.2.1 Tách chiết DNA: ......................................................................................... 27
3.2.2.2 Chạy phản ứng PCR: ................................................................................... 27
3.2.3 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen trên môi trường thạch ở
các nhiệt độ khác nhau: ........................................................................................... 29
3.2.4 Khảo sát sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Linh chi đen ở các pH khác nhau: . 29
3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ carbon khác nhau lên sự sinh trưởng
của nấm Linh chi đen: ............................................................................................. 29
3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng
của nấm Linh chi đen: ............................................................................................. 30
3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên sự sinh trưởng của
nấm Linh chi đen: .................................................................................................... 30
3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên sự sinh trưởng của
nấm Linh chi đen: .................................................................................................... 31
3.2.9 Khảo sát sự sinh trưởng của sợ nấm Linh chi đen trên các môi trường nuôi
cấy tổng hợp khác nhau: .......................................................................................... 31
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 32
4.1 Kết quả quan sát hình thái học nấm sợi: ............................................................... 32
4.1.1 Kết quả quan sát khuẩn lạc: ............................................................................ 32
4.1.2 Kết quả quan sát sợi nấm................................................................................ 33
4.2 Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm Linh chi đen.
.................................................................................................................................... 34
4.2.1 Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm Linh chi đen: ........................... 34
4.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA ............................................. 34

iii



o

C

:

Degree Celsius

𝜇m

:

micromet

bp

:

base pairs

ANOVA

:

Analysis Of Variation

ATP

:


Internal Transcribed Spacer

PCR

:

Polymerase chain reation

P:C:I

:

Phenol : Chloroform : Isoamyl alchol

PDA

:

Potato Dextrose Agar

SDS

:

Sodium dodecyl sulfate

RNA

:


vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Thể quả tự nhiên Amauroderma subresinosum ............................................... 8
Hình 2.2 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum ................................... 8
Hình 2.3 Chu trình phát triển của nấm Linh chi .............................................................. 9
Hình 2.4 Bảng đồ primer ITS ........................................................................................ 20
Hình 4.1 Khuẩn lạc mẫu nấm LC1 ................................................................................ 32
Hình 4.2 Hình thái sợi nấm được quan sát ở tiêu cự X40/0.65 ..................................... 33
Hình 4.3 Hình thái sợi nấm được quan sát ở tiêu cự X100/1.25 ................................... 33
Hình 4.4 Kết quả ly trích bộ gen của 2 mẫu nấm Linh chi đen ..................................... 34
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS ....................................................... 35
Hình 4.6 Kết quả dựng cây phát sinh loài ..................................................................... 36
Hình 4.7 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nhiệt độ
khác nhau........................................................................................................................ 37
Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng hệ sợi của nấm linh
chi đen ............................................................................................................................ 38
Hình 4.9 Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các pH khác nhau
........................................................................................................................................ 38
Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ carbon đến sự sinh trưởng hệ sợi
của nấm linh chi đen ...................................................................................................... 39
Hình 4.11 Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nồng độ
carbon khác nhau............................................................................................................ 40
Hình 4.12 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ nitrogen lên sự sinh trưởng của
nấm linh chi đen ............................................................................................................. 40
Hình 4.13 Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy hệ sợi của nấm linh chi đen ở các nồng độ
nitrogen khác nhau. ........................................................................................................ 41

viii

Châu Á, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu. Ở Trung Quốc, nấm Linh chi đã
được nghiên cứu rất nhiều và sử dụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng
bổ dưỡng, điều hoà huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ,…Tác dụng của Linh chi
đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng dược” trị được bách bệnh. Những nghiên
cứu gần đây cho thấy Linh chi còn có khả năng giải độc chì, điều hòa huyết áp, làm giảm
hàm lượng cholesterol trong máu….[11, 14]
Nấm Linh chi đen là một loại nấm quý, được biết đến với tên gọi Hắc chi, là một
trong sáu loại nấm linh chi quý hiếm (lục bảo linh chi). Nấm linh chi đen có nhiều công
dụng trong việc chữa bệnh, nâng cao sức khỏe cho con người, được ứng dụng rộng rãi
trong y học.
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đề tài “Định danh và khảo sát sự sinh trưởng
hệ sợi của nấm Linh chi đen” được thực hiện, nhằm giúp nâng cao, tối ưu hóa môi

1


trường nuôi cấy, đồng thời định danh phân loài của chủng nấm là khâu quan trọng và
cần thiết để tạo tiền đề cho quá trình nghiên cứu sâu về chủng nấm này được thuận lợi
hơn và giúp bảo tồn nguồn gen bản địa.
1.2 Tình hình nghiên cứu:
Trong nước:
Nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất
khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm
dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm
Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein,
polysaccharide…[26]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho
nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [10].
Một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố như: “Bước đầu nghiên cứu tác
dụng nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số lipid máu ở chuột”
“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum)

(Interleukine-2) và hoạt tính DNA polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng
soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi [14].
Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực
chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và
G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [10]
Có lẽ đa dạng

nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,

triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng
histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp
Cholesterol và hạ huyết áp. [10,11, 26]
3


1.3 Mục đích nghiên cứu:
Định danh chủng nấm linh chi đen bằng phương pháp hình thái học và sinh học
phân tử.
Khảo sát sự phát triển hệ sợi của chủng nấm linh chi đen ở một số điều kiện nuôi
cấy khác nhau (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nồng độ carbon, nồng độ
nitrogen, các môi trường nuôi cấy cơ bản).
1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu:
Đề tài tập trung vào các nghiên cứu cụ thể sau:
-

Định danh chủng nấm linh chi đen được lấy từ phòng thí nghiệm của phòng Vi sinh
ứng dụng của Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM

-


và nguồn nitrogen thích hợp cho nấm sinh trưởng là glucose với nồng độ 20 g/l và yeast
extract với nồng độ 5 g/l.
- Ngoài ra, đối với các loại môi trường nuôi cấy nấm tổng hợp, hệ sợi của nấm phát triển
tốt trên môi trường dịch chiết khoai tây (PDA).
1.7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm các phần:
- Tổng quan tài liệu.
- Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
- Kết quả và thảo luận.
- Kết luận và kiến nghị.
- Tài liệu tham khảo.

5


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm Linh chi
2.1.1. Khái quát chung [1, 2, 8, 10]
Nấm Linh chi được xếp vào “Thượng Dược“, trong sách “Thần nông bản thảo”
cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung
Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát
công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).
Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:
 Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)
 Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)
 Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)
 Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)
 Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)
 Tử chi (Linh chi tím)
Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão

Tomophagus

2.1.3. Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi đen
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)
Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ
Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma (trên 100
loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài). [11]
Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám trên thân cây gỗ.
Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống hoặc không. Khi theo dõi
quá trình phát sinh hình thái ở các loài Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán và
tạo kiểu đính tâm rất tương đồng với các loài Ganoderma mọc tự do dưới đất. Cho nên
có thể xem chi Amauroderma đã phát sinh trực tiếp từ Ganoderma và đây là nhánh phân
hoá lớn nhất trong họ Ganodermataceae (Lê Xuân Thám, 1996) [10].
Mặt trên quả thể nấm Amauroderma subresinosum có màu đen bóng, nhiều nếp gấp
đồng tâm, mép mũ nấm dày và uốn lượng nhấp nhô. Mô nấm là chất gỗ cứng màu nâu
quế, đôi khi ở các mẫu già mô có các đốm chất màu đen, dày 6 – 15 mm. Bào tầng gồm
các ống nấm tròn, có màu trắng đục, dày cỡ 3 – 6(- 10) ống/mm. Phần thịt mô nấm
(context) được cấu tạo bởi 3 loại sợi: sợi dinh dưỡng trong suốt, có vách mỏng, đường
kính cỡ 3 – 5 µm; sợi bện không màu, vách mỏng, đường kính cỡ 1,5 – 2 µm và sợi cứng
màu nâu nhạt, vách dày hóa cứng, đường kính cỡ 3 – 4 µm. [20]
7


Hình 2.1 Thể quả tự nhiên Amauroderma subresinosum [ 30 ]
d

Hình 2.2 Thành phần cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum (Corner, 1983)
a: Hệ sợi dinh dưỡng; b: Hệ sợi cứng trong thịt
nấm
c: Hệ sợi bện trong thịt nấm; d: Bào tử đảm

lại. Hệ sợi nấm (mycelium), còn gọi là hệ sợi dinh dưỡng (vegetative mycelium), len lỏi
trong cơ chất để rút lấy thức ăn. Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng
tế bào. Khi khối sợi đạt đến mức độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, sẽ
bện kết lại tạo thành quả thể nấm. Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành các bào tử
tiềm sinh hay hậu bào tử (chlamydospore).

9


-

Giai đoạn phát triển
Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình thành 1 dạng

đặc biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm (fruit body). Quả thể thường có kích thước lớn
và là cơ quan sinh sản của nấm. Trên quả thể có 1 cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn
sợi nấm, đó là thụ tầng (hymenium). Chính ở đây 2 nhân của tế bào sẽ nhập lại thành 1.
Sau đó sẽ chia thành 4 nhân con hình thành các bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào
tử (basidiospore) hoặc nang bào tử (ascospore). Khi tai nấm trưởng thành, bào tử được
phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục .
2.1.4. Điều kiện sống của nấm linh chi.
2.1.4.1 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm.
Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên sự hình thành quả thể
nấm. Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm với mức độ khác nhau: mức độ tác
động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu, mức độ tác động lớn nhất. Những yếu tố tác
động trực tiếp lên sự sinh trưởng sợi nấm là nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và độ thông
khí:[13]
Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào, kích
thích hoạt động các chất sinh trưởng, các enzym và chi phối toàn bộ các hoạt động sống
của nấm. Mỗi loài nấm có nhu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển khác nhau.

25 – 30oC
Ẩm độ
55 – 60%
90 – 95%
pH
4,5 – 6
4,5 - 6
Cần ánh sáng tán xạ từ
Ánh sáng
Không cần
mọi phía
Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triểnthành
tán mà ở dạng sừng hươu, đuôi gà (Trịnh Tam Kiệt, 1983) [1].
2.1.4.2 Các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến sự sinh trưởng hệ sợi nấm.
Nguồn cacbon: Nguồn cacbon được cung cấp từ môi trường ngoài để tổng hợp
nên các chất như: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát
triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn

11


cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Đối với các loài nấm khác nhau
thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản
là glucose, với nồng độ đường là 2%. [1]
Trong tự nhiên, cacbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn polysaccharide như:
cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất này có kích thước lớn hơn kích thước
của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn tiêu hóa được cơ chất này, nấm tiết ra
emzyme ngoại bào phân hủy cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể
xâm nhập được vào trong thành và màng tế bào. [6, 13]
Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy, cần


Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít, chúng không phải
là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào. Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt
trong hoạt động của enzym. Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần
một lượng rất ít nhưng không thể thiếu. Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin
(vitamin H) và thiamin (vitamin B1).
Bảng 2.2 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng [13]

2.1.5 Các nghiên cứu về nấm linh chi đen:
Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về nấm linh chi đen vẫn chưa
được công bố rộng rãi. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm linh chi đen
được công bố còn ít, điển hình là những nghiên cứu sau:
- Năm 2006, Lê Xuân Thám và công sư đã phát hiện và định danh loài Linh chi
đen Amauroderma subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vườn Quốc gia Cát Tiên
- Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế bào ung
thư từ ba loài nấm Linh chi đen, Linh chi đỏ và Linh chi vàng từ vườn Quốc gia Cát
Tiên, Lâm Đồng. Kết quả tác giả đã tinh sạch được 12 hợp chất ergosterol peroxide có
khả năng kháng 4 dòng tế bào ung thư biểu mô, gan, phổi và vú.

13


- Năm 2011, Đăng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học
của nấm Linh chi đen Việt Nam A.subresinosum. Kết quả xác định được 14 loại acid béo
thiết yếu từ nấm Linh chi đen.
- Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa
của các Polysaccharides thô chiết xuất từ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum.
2.2. Nguyên liệu trồng nấm
Linh chi là loài nấm phá gỗ mạnh, có khả năng sử dụng trực tiếp nguồn cellulose.
Do đó, nguyên liệu nào có cellulose thì nấm Linh chi có thể sống và phát triển.Tại Đài


14


Trong sản xuất người ta bổ sung thêm vào cơ chất chủ yếu là đạm và khoáng. Tùy
từng loại nấm, đạm cho vào phải cân đối với cacbon thì nấm mới phát triển tốt. Mối liên
hệ giữa nguồn đạm (N) và cacbon (C) được biểu thị bằng tỷ lệ C/N. Thường tỷ lệ C/N
trong giai đoạn nuôi tơ là 25/1 và trong thời kỳ ra quả thể là 30/1 – 40/1.[8]
Khuynh hướng hiện nay người ta thích sử dụng phân hóa học, do hàm lượng đạm
cao. [1]
 Urê (CO(NH2)2), có chứa 42 – 46% nitơ
 Ammôn sunphat ((NH4)2SO4), có chứa 20 – 21% nitơ
Việc sử dụng phân bón hóa học làm tăng lượng đạm đáng kể nhờ sử dụng các amon
có chứa nitơ. Khi nitơ được nấm biến dưỡng thì thành phần còn lại của hợp chất bị biến
đổi và làm thay đổi pH của cơ chất [2]. Ngoài ra, người ta còn trộn cám gạo hoặc cám
bắp chứa 1,18% nitơ [8]. Thành phần dinh dưỡng trong cám được thể hiện ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng trong cám [1]

Khoáng chất là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy: P, K Na,
Mg, Ca, Mo, Zn,... Việc bổ sung muối khoáng sẽ làm thay đổi pH hoặc gây các tác dụng
ngược khác và làm tăng giá thành sản phẩm [2]. Các muối khoáng được sử dụng:[1]
Supe lân (Ca(H2PO4)2.H2O + CaSO4), có chứa 14 – 20% P2O5

15


Canxi cacbonat (CaCO3)
Magiê sunphat (MgSO4.7H2O)
2.3 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của những