BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA PHOTORHABDUS SPP. VÀ XENORHABDUS
SPP. TỪ HETERORHABDITIS INDICA VÀ
STEINERNEMA GUANGDONGENSE

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện:
MSSV: 0851110063

PHẠM THỊ HƯƠNG
Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU………………………………………………………………....1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................. 8
1.2. Mục đích của nghiên cứu ............................................................................................ 9
1.3. Nhiệm vụ của nghiên cứu ........................................................................................... 9
1.4. Các kết quả đạt được của đề tài ................................................................................... 9
CHƯƠNG II : TỔNG QUAN.............................................................................................. 11

3.1.2. Địa điểm ............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2. Vật liệu .................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Nguồn tuyến trùng EPN ..................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Nguồn vi sinh vật ................................................ Error! Bookmark not defined.
3.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng.......... Error! Bookmark not defined.
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Phương pháp phân lập ....................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Hình thái ............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Sinh lý ................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập . Error! Bookmark not defined.
3.3.5. Thử nghiệm sinh hóa .......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.6. Hoạt tính sinh học .............................................. Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.
4.1. Kết quả phân lập hai chủng vi khuẩn khảo sát .......... Error! Bookmark not defined.
4.2. Hình thái khuẩn lạc ................................................... Error! Bookmark not defined.
4.2.1. Quan sát khuẩn lạc ............................................. Error! Bookmark not defined.
4.2.1. Nhuộm Gram (quan sát vi thể) ........................... Error! Bookmark not defined.
4.2.3. Nhuộm tiên mao.................................................. Error! Bookmark not defined.
4.3. Thử nghiệm sinh lý................................................ Error! Bookmark not defined.
4.3.1. Di động ............................................................... Error! Bookmark not defined.
4.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập .... Error! Bookmark not defined.
4.5. Thử nghiệm sinh hóa ................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.1. Kết quả thử nghiệm catalase .............................. Error! Bookmark not defined.
4.5.2. Lên men lactose .................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.3. Indole .................................................................. Error! Bookmark not defined.
4.5.4. Khử nitrate.......................................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.5. Phân giải tinh bột ............................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.6. Sinh hơi H2S ....................................................... Error! Bookmark not defined.
4.5.7. Thử nghiệm phân giải lipase .............................. Error! Bookmark not defined.
4.5.8. Thử nghiệm phân giải protease .......................... Error! Bookmark not defined.


Entomopathogenic Nematodes

 HBHL: Hydroxybutanoyl homoserine lactone
 IJs:

Infective Juveniles

 NBTA: Nutrient bromothymol blue agar

 PDA:

Potato glucose agar

 QS:

Quorum Sensing

 TSA:

Tryptone Soya Agar

 VKCS: Vi khuẩn cộng sinh

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng ...................................................... 14
Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus .......................................... 16
Hình 2.3. Vai trò của pha I .................................................................................................. 19
Hình 2.4. Vai trò của pha II ................................................................................................. 19
Hình 2.5. Giả định về khả năng gây độc của X.nematophila .............................................. 25
Hình 2.6. Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) ............................. 28
Hình 2.7. Các hướng ứng dụng của vi khuẩn cộng sinh ...................................................... 42
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2. Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica............. Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.3. Phân lập Xenorhabdus từ Steinernema guangdongense ..... Error! Bookmark not
defined.
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc quan sát qua kính hiển vi ..... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.3. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined.
Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện ................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi ... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined.
Hình 4.7. Hình thái tiên mao ............................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.8. Hình thái vi khuẩn khi nhuộm gram .................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.9. Hiện tượng thử nghiệm catalase .......................... Error! Bookmark not defined.
Hình 4.10. Hiện tượng thử nghiệm di động trên đĩa thạch .. Error! Bookmark not defined.
Hình 4.11. Hiện tượng thử nghiệm di động trong ống nghiệm .......... Error! Bookmark not
defined.
Hình 4.12. Hiện tượng thử nghiệm lên men lactose ............ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.13. Hiện tượng thử nghiệm indole ........................... Error! Bookmark not defined.


7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU
----oOo---1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh
mẽ cả về số lượng và chất lượng, trong đó một số mặt hàng nông sản như cà phê,
lúa gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trường quốc tế. Nhu cầu
tăng sản lượng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang được đặt ra,
đi đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn.
Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu như tất cả các nước nông
nghiệp người nông dân ít được trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo
tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi người nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ
sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết được tác hại
nhưng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lượng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà
không tuân thủ các quy định về liều lượng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên
nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Không những vậy, thế giới
đang phải đối mặt với vấn đề nhức nhối là tồn dư quá mức của các chất hóa học có
thể gây hại cho sức khỏe con người trong các sản phẩm nông nghiệp. Vì vậy xu
hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang trở nên rất hữu ích vì tiết
kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho con người, đồng
thời tính an toàn môi trường cao.
Trong các biện pháp sinh học được sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang
được các nước trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến
trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt vi khuẩn cộng
sinh trong ruột chúng, nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng, gồm

- Phân lập các chủng thuộc hai chi vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus.
- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với ba loài vi
khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella và loài nấm Phytophthora tại
hai thời điểm cấy chuyền là sau lần đầu tiên và lần thứ 7 cấy chuyền.
1.4. Các kết quả đạt được của đề tài
- Phân lập được hai chủng vi khuẩn P1 và X1 thuộc hai chi Photorhabdus và
Xenorhabdus.

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Kết quả khả năng đối kháng cho thấy sự thể hiện khả năng đối kháng của
P1 và X1 với các vi khuẩn, nấm gây hại. Mức đối kháng của mỗi chủng với mỗi
loài thử nghiệm là khác nhau và sau hai thời điểm cấy chuyền là khác nhau.

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN
----oOo---2.1. Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)
2.1.1. Khái niệm EPN
EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để
chỉ các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis,
chúng vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng.
Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp được hình thành trong tự
nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống

dụng.
g. Có khả năng chủ động đi tìm vật chủ và giết chết chúng sau 48h.
h. Tồn tại bền bỉ trong đất và nhân nhanh khi gặp sâu hại nên chỉ cần phun
chế phẩm EPN cho cả một quá trình lâu dài.
i.

Dễ dàng tuyển chọn các chủng đạt yêu cầu theo nhu cầu sử dụng.

2.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng
2.2.1. Phân loại
Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã được tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng:
- Aphelenchida
- Diplogasterida
- Mermithida
- Oxyurid
- Rhabditida
- Tylenchida
Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng
nhất.
Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã được đề cập:
- Họ Steinernematidae với hai giống Steinernema và Neosteinernema
- Họ Heterorhabditidae với chỉ một giống Heterorhabditis.
Steinernema đã được Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên
này đã được sử dụng trước đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,
trước năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana.
Hiện nay có khoảng 56 loài đã được mô tả. Neosteinernema được Nguyễn và Smart
mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối.
Heterorhabditis được Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây được
đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có
nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này (Nguyễn Bá Khương).

Panagrolaimomorpha

Họ
Giống

Steinernematidae
Steinernema

Neosteinernema

Heterorhabditiae
Heterorhabditis

2.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis
Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJs) mang vi khuẩn cộng sinh trong
ruột. Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng
sẽ phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn
trùng. Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tương của côn trùng tạo ra hiện tượng
ngộ độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn
sẽ phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh
dưỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn
dinh dưỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng như
hình 2.1.

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh
nha bào. Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số
vi khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế
bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella.
c. Sinh lý
Các vi khuẩn đường ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển
được trên các môi trường nuôi cấy thông thường.
d. Tính chất sinh hóa
Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết
catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite.
Lên men một số đường như glucose, galactose hoặc không lên men một số
đường như lactose, manose, saccharose.
Có thể có một số enzyme như urease, tryptophanase.
Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lưu
huỳnh.
2.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus
Bảng 2.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus
Phân loại

STT
1

Giới

Bacteria


Xenorhabdus

Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy
mối quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1.

15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

2.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản
Đây là hai chi có sự tương tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên
có thể phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản được nhắc đến trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus
STT
1

Đặc điểm
Trình tự 16S rRNA

Photorhabdus

Xenorhabdus

Tại vị trí 208 – 213

Tại vị trí 208 – 211


sinh

Điều kiện phát triển tốt
nhất là 280C hoặc nhỏ
hơn, một vài chủng phát
triển ở 40C.

Heterorhabditis

Steinernema

Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc
từng loài và chủng cụ thể.
a. Đặc điểm sinh lý nổi bật
Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá
trình lên men và hô hấp trong tế bào.
Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tượng biến đổi pha, đây được coi
là một hiện tượng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.
 Hiện tượng biến đổi pha:
Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn
về một số điểm như hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn.
Nguyên nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của
các protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng
nguyên ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ
cấp) là dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể
xuất hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trưởng.
 Đặc điểm của hai pha:
Đặc điểm trước tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu
môi trường để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhưng ngược lại pha thứ cấp lại
không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trưng như pha I. Một đặc điểm rất


NBTA

đỏ hoặc nâu sẫm.

Xung quanh khuẩn lạc có Không tạo thành vùng
vùng trong, một phần agar trong suốt bao quanh.
bị biến màu.
Sắc tố tạo thành trong môi Phụ thuộc chủng và môi Phụ thuộc chủng và môi
trường lỏng

trường. Ở P. luminesens có trường. Thường có màu
màu thay đổi từ tím đến vàng thẫm, da cam. Màu
màu tía khi tăng nồng độ thay đổi không mạnh khi
thêm NaOH do nồng độ sắc

NaOH.

tố thấp.
Hình dạng và hình thái tế Tế bào dạng que, kích Tế bào tương đối dài, kích
bào

thước nỏ đến trung bình thước nhỏ đến trung bình
(dài 3 - 5
2

, rộng 1,5 – (6-7

, rộng 1 - 1,5



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Vai trò của hai pha:
Pha I (pha sơ cấp):
Tế bào vi khuẩn
cộng sinh

Tạo các enzyme
ngoại bào

Tạo các chất kháng
sinh

Cung cấp dinh
dưỡng

Bảo vệ xác côn
trùng

Hình 2.3. Vai trò của pha I

Đây là pha được coi là đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh
đối với côn trùng gây hại và cung cấp dinh dưỡng để tuyến trùng phát triển, sinh
sản. Pha I có rất nhiều enzyme như protease, lipase, lecithinase, các enzyme này
đóng vai trò trong việc phá vỡ các đại phân tử trong cơ thể côn trùng để cung cấp
dinh dưỡng cho sự phát triển của chính nó và tuyến trùng. Mặt khác, có rất nhiều
các hợp chất kháng sinh đã được tìm thấy ở pha này, chúng có nhiệm vụ tấn công
côn trùng và bảo vệ xác côn trùng khỏi sự xâm nhập của các loài vi sinh vật cạnh
tranh chất dinh dưỡng ở xác côn trùng.

tiểu đơn vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao
của vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus được đánh giá có vai trò trong gây độc
vì bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt
động.
* Tiên mao:
Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy
rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động.
Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đưa vi khuẩn
đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các
nguồn dinh dưỡng.
Trong hầu hết chủng X. nematophila đã được kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể
hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có
tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu
tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa
20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi
trong tế bào thứ cấp nhưng không được sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị
điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện
của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ
cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD.
c. Đặc điểm sinh hóa
* Photorhabdus
Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus,
hầu hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae
Bảng 2.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus
Kết quả


 Phân giải tween 20
 Tween - 40, 60, 80 và 85

+
Hầu hết +

 Acid hóa fructose, D - mannose, maltose,

Hầu hết +

ribose, N – acetylglucosamine
Lên men từ glycerol

+ yếu

Nguồn cacbon và năng lượng từ fumarate,

+

glucosamine, L - glutamate, L - malate, L proline, Succinate, L – tyrosine
Phát quang

+

+ yếu

Hấp thu màu môi trường

+

+

Tan huyết cừu

Hầu hết +

Tan máu ngựa

Hầu hết +

Phân giải tween 20

+

Tween - 40, 60, 80 và 85

Hầu hết +

Acid hóa glucose

+

Di động

+

+ yếu

Hấp thu màu môi trường


P. luminescens
laumondii

luminescens

H.
Phân lập

Heterorha

bacteriopho

bditis spp.

ra nhóm
Brecon

P.
luminescens
akhustii

H.
bacteriophor

P. temperata

H. indica

a nhóm HP88



+

+

+

+

Indole

+

+

+

d

[-]

Simon’s citrate

d

+

D

d


[+]

[-]

-

D

-

[-]w

Myo- inositol

d

+

[+]

[+]

dw

d- mannitol

d

dw


d

+

[-]

+

+

d

+

-

d

+

Phân hủy
aesculin
Urease
Phenylalanine
deaminase
Tryptophan
deaminase

Phân hủy máu

nematophila

X. bovienii

X.
poinarii

X.
beddingii

X.
japonica

S. carpocapsae

+

-

-

-

-

-

+

-


-

+

35

32

40

39

35

+

+

-

+

-

d

D

D


+

-

d

[-]

[-]

-

dw

-

+

-

+w

-

+w
+
+w
-


mô tả
S. kushidai
Nhiệt độ tối ưu
để phát triển
Gây độc cho
lepidopteran
Di động
Hấp thụ màu
sắc
Simmon’s
citrate
Phân giải
aesculin
Phenylalanine
deaminase
Tryptophan
deaminase
Myo-inositol
Ribose
Salicin
Diaminobutane
D,L-Glycerate
L(-)Histidine
Myo-inositol
Ribose
L-Tyrosine

24