BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

VIỆN DƢỢC LIỆU

HOÀNG MINH CHÂU
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI
TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA
SYLVESTRE (RETZ.) R. Br. EX SCHULT.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.

THỰC VẬT HỌC ........................................................................................... 3

1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br. ............ 3
1.2. Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài ................ 6
2.

4.4. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng và bộ phận của cây. ... 30

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 33
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................... 33


2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................. 33
2.1.2. Vật liệu, dung môi, hóa chất .......................................................................... 34
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ................................................... 35
2.1.4. Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu .............................................. 37
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 38
2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học..................................................................... 38
2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập ............................................... 38
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học ........................................................................ 38
2.2.2.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng
huyết ............................................................................................................................. 39
2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa
canh .............................................................................................................................. 39
2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc ............. 41
2.2.2.3.1. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất. ... 41
2.2.2.3.2. Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 .......................................... 42
2.2.2.3.3. Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các
chất phân lập. ............................................................................................................... 43
2.2.2.3.2.4. Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang ................................. 43
2.2.2.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả ................................................................ 43
2.2.3. Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh ................... 44
2.2.3.1. Phƣơng pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon ............................... 44
2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 46

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 106
4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 106


4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................ 107
4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ..................................................................... 112
4.3.1. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết Dây thìa canh .......................... 112
4.3.2. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập từ Dây thìa canh ......... 115
4.4. VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT ............................................. 117
4.5. BÀN LUẬN CHUNG .................................................................................... 119

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 121
1. Về thành phần hóa học .................................................................................... 121
2. Về tác dụng sinh học ........................................................................................ 122
3. Về động thái tích lũy hoạt chất ....................................................................... 122
ĐỀ XUẤT .................................................................................................................. 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.),
thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc,
Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000
năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu
tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc
…liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng
sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh lý

Về thử tác dụng sinh học:
- Thử tác dụng in vivo tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết toàn phần lá
Dây thìa canh.
- Thử tác dụng in vitro tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập
đƣợc từ lá Dây thìa canh.
Về nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất:
- Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất chính trong lá Dây thìa
canh.
- Theo dõi sự thay đổi hàm lƣợng hoạt chất của các mẫu lá Dây thìa canh
thu hái trong năm.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1. THỰC VẬT HỌC
1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br.
 Vị trí phân loại
Có hai quan điểm khác nhau về vị trí phân loại của chi Gymnema R. Br.
Quan điểm thứ nhất cho rằng chi Gymnema R. Br. thuộc họ Thiên lý
(Asclepiadaceae). Đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điển đều theo quan
điểm này [19]. Một số tài liệu về thực vật ở Việt Nam cũng xếp chi Gymnema
R. Br. vào họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [2], [7],[8].
Tuy nhiên, năm 2009 Takhtajan đã công bố hệ thống phân loại trong đó xếp
Gymnema R. Br. là một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là
Apocynaceae [17]. Cho đến nay, quan điểm này đƣợc thừa nhận rộng rãi trong
các hệ thống phân loại quốc tế [32],[79]. Theo đó, Gymnema R. Br. là một chi
thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae), họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ
Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan
(Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [17].


Gymnema acuminatum Wall.

Nepal, Ấn Độ, Malaysia [80]

2

Gymnema albidum Decne.

Timor [80]

3

Gymnema albiflorum Costantin

Việt Nam [91]

4

Gymnema brevifolium Benth.

Úc [80]

5

Gymnema calycinum Schltr.

Luzon [80]

6

11 Gymnema dunnii (Maiden & Betche) Úc [80]
P.I.Forst.
12 Gymnema elegans Wight & Arn.

Tamil Nadu [80]

13 Gymnema erianthum Decne.

New Caledonia [80]

14 Gymnema foetidum Tsiang

Việt Nam [1], Trung Quốc [20]
4


STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R.

Phân bố

Br. đƣợc chấp nhận [50]
15 Gymnema glabrum Wight

Myanmar [80]

16 Gymnema griffithii Craib

Thái Lan, Việt Nam

17 Gymnema hainanense Tsiang

24 Gymnema lactiferum (L.) R.Br. ex Ấn Độ, Sri lanka [80]
Schult.

26 Gymnema littorale Blume

Trung Quốc [75]; Ấn Độ, Nepal;
Đông Nam Á [80]
Java [80]

27 Gymnema longiretinaculatum Tsiang

Trung Quốc [20]

25

Gymnema latifolium Wall. ex Wight

28 Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Thành phố Assam [80]
Wilcock
29 Gymnema macrothyrsa Warb.

Sulawesi [80]

30 Gymnema maingayi Hook.f.

Malacca [80]

31 Gymnema mariae Schltr.

Philipin [80]

Phân bố

Br. đƣợc chấp nhận [50]
38 Gymnema pleiadenium F.Muell.

Queensland [80]

39 Gymnema recurvifolium Blume

New Guinea [80]

40 Gymnema rotundatum Thwaites

Sri Lanka [80]

41 Gymnema rufescens Decne.

Madagascar [80]

42 Gymnema schlechterianum Warb.

Philipin [80]

43 Gymnema spirei Costantin

Lào [80]

44 Gymnema suborbiculare K.Schum.

New Guinea [80]


1.2.

Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài

Theo Danh lục các loài thực vật Việt Nam của Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật xuất bản năm 2005, chi Gymnema tại Việt Nam có 8 loài là: Gymnema
albiflorum Cost., Gymnema alterniflorum (Lour.) Merr., Gymnema foetidum
Tsiang, Gymnema griffithii Craib, Gymnema inodorum (Lour.) Decne,
Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema reticulatum (Moon) Alston,
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult [6].
Bảng 1.2. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam
TT

Tên khoa học

Tên thƣờng dùng

6

Phân bố


1

Gymnema albiflorum

Loã ti hoa trắng

Hà Tây [92]


Các tỉnh giáp
Campuchia
Rau mỏ

(Lour.) Decne.

Bắc Kạn, Thái
nguyên, Hoà Bình,
Ninh Bình, Khánh
Hoà [92]

6

Gymnema latifolium

Loã ti lá rộng

Wall ex Wight
7

Hoà Bình, Ninh
Bình, Kon Tum [92]

Gymnema reticulatum
(Moon) Alst.

8

Gymnema sylvestre

Các hợp chất saponin khung olean phân lập từ G. sylvestre gồm các acid
gymnemic, gymnemasaponin, gymnemosid, gymnemasin,… Chúng có cấu tạo
từ khung olean (hình 1.1), khác nhau ở vị trí các nhóm thế ( hình 1.2). Ngoài ra,
tại Việt Nam, năm 2011, Trần Văn Ơn và cộng sự đã phân lập đƣợc một
saponin có khung olean từ lá của G. sylvestre là glochioeriosid A [5].

Hình 1.1. Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult

8


Hình 1.2. Cấu trúc các nhóm thế của hợp chất saponin khung olean trong
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài G.sylvestre trên thế giới chủ yếu từ
mẫu thu tại Ấn độ và Trung Quốc, tuy cùng là các saponin tritecpen phân lập
đƣợc từ cùng loài này nhƣng có một sự khác biệt rõ ràng, tất cả mẫu thu của Ấn
Độ đều có nhóm thế OH hay O-Glc tại ví trí C23, còn mẫu thu tại Trung Quốc
thì không có nhóm OH gắn vào vị trí C23 [34], [42],[57] [71].

9


Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có khung olean trong Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult
S
T

Tên hợp chất

R1


[33, 36, 42, 45, 69]

T
1.

CH2OCOCH
3

2.

Acid gymnemic II

-glA

CH2OH

OH

CH2OCOCH
3

3.

Acid gymnemic III

-glA

CH2OH


Acid gymnemic V

-glA

CH2OH

OH

CH2OH

-O-Tga

[33, 36, 42, 45, 69]

6.

Acid gymnemic VI

-glA3-glc

CH2OH

OH

CH2OH

OH

-O-Tga


Acid gymnemic VIII

Acid gymnemic IX

-glA3OG
-glA3OG

10

-OTga


S
T

Tên hợp chất

R1

R2

R3

Acid gymnemic X

-glA

CH2OH

OH

CH2OCOCH
3

10.

Acid gymnemic XI

-glA

CH2OH

OH

11.

Acid gymnemic XII

-glA3-glc

CH2OH

OH

- CH2O-Tga
CH2OCOCH
3

12.

Acid gymnemic XIII


[42]

14.

Acid gymnemic XV

-glA

CH2OH

OH

CH2OH

-O-Mba

[42]

15.

Acid gymnemic XVI

-glA

CH2OH

OH

[42]


Tên hợp chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

TLTK

-glA

CH2OH

OH

CH2O-Bz

OH

OH

[42]


CH2O-glc

OH

CH2O-glc

H

H

[71]

H

H

[42],[71]

H

H

[42],[71]

H

H

[42], [45], [71]


-glA

CH3

OH

CH2OH

H

H

[57]

24.

Gymnemasaponin 7

-glA

CH3

OH

CH2OH

H

O-Bz



S
T

Tên hợp chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

TLTK

CH3

H

-COOH

H

H

6

28. Gymnemasaponin 11 -glc -glc

CH3

H

-CO-O-glc6glc

29.

Gymnemosid a

glA

CH2OH

OH

CH2OH

-O-Ac

-O-Tga

[45]

30.


O-Bz

[45]

OH

CH2OH

H

OH

[45]

-CH2O32.

Gymnemosid d

H

glc6-glc6glA

13


S
T

Tên hợp chất



glc -glc -

OH

glA

CH2-O-glc6glc

34.

Gymnemosid f

[45]

35.

Gymnemasin A

-glA3-glc

CH2OH

OH

CH2OH

36.

Gymnemasin B


CH2OH

39.

Gymnemosid W1

-glc6-glc

CH3

OH

40.

Gymnemosid W2

CH3

OH

-glAOMe

14

-O-

H

[69]


Tga
OH
-OTga


* Gymnema alternifolium (Lour.) Merr
Từ rễ của loài G. alternifolium, tác giả Kazuko Yoshikawa đã phân lập
đƣợc 19 saponin có khung olean [27],[40].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học chung của các alternosid phân lập từ loài G.
alternifolium (Lour.) Merr

Hình 1.4. Cấu trúc các nhóm thế trong các hợp chất alternosid phân lập
từ loài Gymnema alternifolium (Lour.) Merr
Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học các hợp chất alternosid phân lập từ Gymema
alternifolium (Lour.) Merr

15


STT

Tên chất

R1

R2

R3


[27]

3

Alternosid III

-glA3-glc

O-tig

-rha

H

[27]

4

Alternosid IV

-glA

O-Ac

-rha

H

[27]


Alternosid VII

-glA3-glc

OH

H

H

[27]

8

Alternosid VIII

-glA

OH

-glc

H

[27]

9

Alternosid IX


O-Tga

H

H

[40]

12

Alternosid XII

-glA3-glc

OH

-Tga

H

[40]

13

Alternosid XIII

-glA3-glc

OH


H

[40]

16

Alternosid XVI

-glA3-glc

O- Tga

-xyl

H

[40]

17

Alternosid XVII

-glA

O- Tga

-rha

H


 Gymnema inodorum (Lour.) Decne
Năm 2001, từ lá của G. inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập
đƣợc 4 hợp chất thuộc nhóm olean saponin là GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7
[70]. Cấu trúc phân tử của chúng đƣợc trình bày ở hình 1.5.

16


Hình 1.5. Cấu trúc của một số saponin có khung olean phân lập từ loài
Gymnema inodorum (Lour.) Decne
Bảng1.5. Cấu trúc hóa học một số saponin có khung olean của Gymnema
inodorum (Lour.) Decne
STT

Tên chất

R1

R2

R3

R4

TLTK

1

GiA-1


OH

H

-glc

[70]

4

Gi-A7

O-NMAt

OH

H

H

[70]

Trong đó: -glc: β-D-glucopyranosyl, O-NMAt: -O-N-methylanthraniloxy
2.1.2. Saponin có khung damaran
Năm 1992, từ lá của G. sylvestre, Kazuko Yoshikawa và cộng sự đã phân
lập đƣợc 12 saponin thuộc nhóm dammaran, gồm các gymnemasid I –VII, các
gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII và LXIII [72]. Cấu trúc của chúng
đƣợc trình bày ở hình 1.6, 1.7, 1.8 và bảng 1.6.


glc

[72]

2

Gymnemasid II

-glc2-glc

glc

[72]

3

Gymnemasid III

-Ara2-glc

glc

[72]

4

Gymnemasid IV

-glc


-glc6-xyl

[72]

Năm 2015, tác giả Trung Quốc Rui Xu và công sự đã phân lập đƣợc từ dịch
chiết ethanol thân G. sylvestre mẫu thu ở tỉnh Quảng Tây 5 pregnan glycosid,
trong đó có 4 chất mới lần đầu tiên phân lập đƣợc từ Dây thìa canh, đặt tên là
gymsylvestrosid ( A-D) [61].
 Gymnema alternifolium (Lour.) Merr
Năm 1998, từ rễ của G. alternifolium, tác giả Kazuko Yoshikawa và
cộng sự đã phân lập đƣợc 6 polyoxypregnan glycosid là các gymnepregosid
A-F [38]. Nghiên cứu sau đó của cùng nhóm tác giả năm 1999 đã phân lập
đƣợc 11 polyoxypregnan glycosid khác từ rễ của G. alternifolium là các
gymnepregosid G-Q [39].
2.2.

Các nhóm chất khác

2.2.1. Nhóm flavonoid glycosid

19


Năm 2004, tác giả X. Liu và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 hợp chất flavonol
glycosid từ lá của G. sylvestre là kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranosid,
robinobiosid, rutin, quercetin

kaempferol

3-O-robinobiosid và tamarixetin


20