LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress
hormone Dopamine

lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (Early mortality syndrome
(EMS)) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” là công trình nghiên cứu thực
của cá nhân tôi, được thực hiện trên lý thuyết và kiến thức và sự hướng dẫn của
Th.s Nguyễn Thảo Sương.
Số liệu được dùng trong đề tài hoàn toàn trung thực, có nguồn gốc cụ thể, rõ
ràng. Đề tài có dùng tài liệu tham khảo được đăng tải trên sách, tạp chí, báo
cáo,trang web, các từ khóa liên quan đến khóa luận, đồ án trong và ngoài nước.

TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Tô Thị Thơm


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà em đã hoàn
thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép em được gửi lời cảm ơn sâu sắc và
chân thành đến:
Đầu tiên em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thảo Sương người trực tiếp hướng dẫn
đồ án trong thời gian vừa qua. Trong suốt thời gian thực hiện, chị đã tận tình hướng
dẫn, hỗ trợ cũng như truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp em giải quyết các vấn đề
nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu.
Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh,
Viện Nghiên cứu nôi trồng thủy sản 2, đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi


IHHNV

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

LB

Luria Broth

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

TSA

Trytic Soya Agar

TSB

Trytic Soya Broth

TSV

Taura syndrome virus

VP

Vibrio parahaemolyticus

WSSV


Ml

Mililitre

H

Hour

LSI

Larval Stage Index

Mg

Miligram

i


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng và tối ưu của Vibrio parahaemolyticus. ........................... 6
Bảng 3.1: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau
16h. .................................................................................................................................. 39
Bảng 3.2: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung
huyết, phân giải casein, phân giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ
sung của stress hormone . ...............................................................................................
41

Hình 3.2: Biểu đồ đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm)
sau 16h ..................................................................................................................................... 41
Hình 3.3: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc
phân
giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone .............. 42
Hình 3.2: Khả năng dung huyết của Vibrio parahaemolyticus ở lần lượt các nồng
độ
ĐC, 50µM, 100µM. ............................................................................................................... 43
Hình 3.3: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung
huyết đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone . ........................ 43
Hình 3.3: Khả năng thủy phân casein của Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ
ĐC,50µM, 100µM..................................................................................................................44
Hình 3.4: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc phân

3


Đồ án tốt nghiệp

giải casein và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress
hormone…………………………………………………………………………………… 44
Hình 3.4: Khả năng di động của VP ở các nồng độ ĐC, 50µM, 100µM, 0.05
LED209, 0.1 LED209...............................................................................................

45

Hình 3.5: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h
có/không bổ sung stress hormone và chất ức chế stress hormone................................46
Hình 3.6: Thí nghiệm 1 (N=16) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí
ngiệm cảm nhiễm với V. Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất

2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ..............................................................................................
2
4. Mục đích nghiên cứu............................................................................................... 2
5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 2
6. Các kết quả đạt được của đề tài .............................................................................. 3
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................
5
1.1

Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus ..................................................................... 5

1.1.1

Phân loại........................................................................................................ 5

1.1.2

Đặc điểm ....................................................................................................... 5

1.1.3

Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi

trồng thủy sản.............................................................................................................
7
1.1.4

Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ....................... 13


Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng ................................................ 24

1.3.3

Một số bênh thường gặp trên tôm thẻ chân trắng ...................................... 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 33
2.1

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 33

2.2

Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 33

2.2.1

Hóa chất và môi trường .............................................................................. 33

2.2.2

Dụng cụ ....................................................................................................... 34

2.3

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 34

2.3.1


parahaemolyticus cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng ...............................................
44
3.3.1

Kết quả thí nghiệm LD50 ........................................................................... 44

3.3.2

Kết quả thí nghiệm challenge ..................................................................... 45
7


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 49
4.1

Kết luận .............................................................................................................. 49

4.2

Kiến nghị............................................................................................................ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 50

vii


Đồ án tốt nghiệp


1


2. Tình hình nghiên cứu
Một số nghiên cứu gần đây đã xác định rằng stress hormone catecholamine
làm gia tăng độc lực của vi khuẩn và có thể bị ức chế bằng cách sử dụng các chất
đối kháng catecholamine LED 209 (sperandio et al, 2003). Tuy nhiên nghiên cứu
này là rất hiếm và cho đến nay chưa có báo cáo nào về tác dụng của stress hormone
và chất ức chế stress hormone ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus chủng gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong việc tìm kiếm nỗ lực nhằm tìm kiếm một chiến lược mới để kiểm soát
bệnh EMS ở Đồng bằng sông Cửu Long. Ở đề tài này, chúng tôi sẽ tập trung khảo
sát và tìm ra mối quan hệ giữa stress hormone Dopamine và chất ức chế stress
hormone LED 209 lên độc lực của vi khuẩn VP gây bệnh tôm chết sớm trên tôm thẻ
chân trắng.
4. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu là để khảo sát ảnh hưởng của stress hormone
Dopamine, chất ức chết stress hormone (LED 209) lên các yếu tố độc lực của vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bao gồm khả năng di động, khả năng dung huyết,
khả năng phân giải casein và phân giải chitin in vitro và in vivo.
Mục đích việc hoàn thiện các mục tiêu trên là giúp làm sáng tỏ cơ chế độc lực
của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ngăn chặn và giảm thiểu tác động cả bệnh
EMS về sản xuất tôm thẻ chân trắng ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam.
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu thập thông tin
Phương pháp thu thập thông tin bao gồm:
-

Phương pháp nghiên cứu tài liệu.


Khả năng dung huyết, khả năng thủy phân casein, khả năng phân giải
chitin: ở cả 3 thử nghiệm này đều thấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
có khả năng dung huyết, thủy phân casein, phân giải casein nhưng không
có sự khác biệt quá lớn giữa các môi trường có/không bổ sung stress
hormone Dopamine và chất ức chế stress hormone LED 209.

Thí nghiệm invivo
-

Thí nghiệm LD50: kết qủa thí nghiệm cho thấy bổ sung 106cfu/ml làm cho
vi khuẩn VP chết 50%.

-

Thí nghiệm challenge:
Stress hormone dopamine: không thể hiện rõ tác dụng làm gia tăng
độc lực của vi khuẩn VP khi thí nghiệm cảm nhiễm trên tôm
thẻ chân trắng.


Chất ức chế stress hormone LED 209: LED 209 ở nồng độ 0.1µM ở
thí nghiệm 2 và 3 không thể hiện rõ tác dụng làm giảm độc lực của
VP khi thí nghiệm cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng, ở nồng độ
0.05µM thể hiện rõ sự khác biệt ở các thí nghiêm 1, 2, 3.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Kết cấu đồ án tốt nghiệp bao gồm: 3 chương.
-

Chương 1: Tổng quan tài liệu.


Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS, CHrom agar.


Các loại V.parahaemolyticus cũng có thể lây lan từ bố mẹ và ấu trùng. Ví dụ
như mầm gây bệnh nên bệnh hoại tử gan cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis
disease- AHPND) hiện diện ở rất nhiều loai tôm và ở các giai đoạn phát triển khác
nhau. Điều này giải thích tại sao chúng có thể dễ dàng bùng phát, lây lan và vấn đề
tiêu diện hoặc kiểm soát mầm bệnh này không hề đơn giản.

Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus
(Nguồn: -h-c-c-a-vikhu- n-vibrio-parahaemolyticus)
Vibrio parahaemolyticus được phát hiện ở ngoài biển và thường kí sinh trên
tôm, cua, cá, ốc,…và chúng phát triển được ở môi trường có 1- 8% NaCl, không
sinh trưởng được trong môi trường không có muối. Chúng không thể sống khi nhiệt
độ xuống dưới 40C, pH tối ưu sống trong môi trường 7% NaCl.
Theo tổ chức FAO năm 2011, V. parahaemolyticus có khoảng chịu đựng và
khoảng tối ưu như sau:
Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng và tối ưu của Vibrio parahaemolyticus.
Y
ếu
N
hi
Đ
ộ
P
h
Đ
iề
H

Khi nguồn hữu cơ trong ao cao.

•

Khi độ mặn cao.

•

Khi pH cao.

•

Khi ao nuôi có nhiều ốc, hàu và ký sinh trùng,…

1.1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi
trồng thủy sản
1.1.3.1 Tình hình dịch bệnh

Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS trên tôm
( Nguồn: Nguyễn Thảo Sương (2011-2013) tạp chí nghề cá Sông Mekong, Viện
Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản 2, Hồ Chí Minh)
Bệnh tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome- EMS) hay còn được gọi là
chứng hoại tử gan- tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome- AHPNS)
được xác định là bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, cư trú trong


đường tiêu hóa của tôm và phát triển theo cơ chế khá phức tạp. Bệnh xuất hiện đầu
tiên ở miền nam Trung Quốc năm 2009 và lan rộng ra các nước ASEAN như Việt
Nam, Malaysia, Thái Lan,… gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm thế giới nói
chung và Châu Á nói riêng..

để kiểm soát dịch bệnh tốt hơn, tránh gây thiệt hại cho ngành thủy sản nói chung và
nuôi tôm nói riêng trên toàn cầu.
(Nguồn: />Trong nước
Ở Việt Nam vào tháng 6 năm 2011, đã có báo cáo về thiệt hại do bệnh EMS
gây ra nhưng không quá lớn, ban đầu bệnh EMS xuất hiện ở 6 tỉnh gồm: Tiền
Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạ Liêu và Cà Mau. Bệnh EMS trên tôm
thẻ chân trắng thật sự bùng phát và lây lan nhanh chóng vào năm 2012. Theo thống
kê của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Sóc Trăng (2012) cả nước đã ghi
nhận 15 tỉnh có vùng nuôi tôm nhiễm bệnh EMS với diện tích 35.245ha, năm 2013
số vùng có tôm bị nhiễm bệnh EMS lên tới con số 18 tỉnh, trong đó thiệt hại nặng
nhất là Bạc Liêu với diện tích 2.174ha và Trà Vinh với diện tích 2.070 ha với tỷ lệ
tử vong có thể vượt quá 70% (Whitehead RJ , 2013).
Do tính chất phức tạp của giống vi khuẩn Vibrio, làm cho việc kiểm soát và
khống chế mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPNS trở nên rất phức tạp và khó
khăn, trực tiếp gây tổn hại đến vật chủ. Hầu hết mầm bệnh vi khuẩn Vibrio sau khi
xâm nhập vào vật chủ chúng sẽ nhanh chóng phát triển, gia tăng mật số để bảo vệ
chính nó và cùng với sự phát triển của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu đi và
dẫn đến cái chết. Dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPNS
không tấn công và xâm nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các
cơ chế xâm nhập khác. Điều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thể
ngăn chặn các nhiễm trùng do EMS/AHPNS gây nên. Nếu như kháng sinh không
thể tiếp xúc với mầm bệnh ở mức độ đủ để ảnh hưởng đến nó thì kháng sinh sẽ
không thể phát huy tác dụng. Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng đến kháng
sinh trong việc điều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh để trị bệnh EMS/AHPNS là


một ví dụ rất điển hình về việc sử dụng kháng sinh không hiệu quả. Ẩn mình trong
vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là
tác nhân gây bệnh EMS/AHPNS được bảo vệ trước các hóa chất về mặt lý thuyết là
có thể tiêu diệt chúng. Điều này đặt ra một thách thức rất lớn đối với các cố gắng


Nhiều trường hợp ghi nhận tôm ngưng chết khi ngưng ăn và sau đó chết rất
nhanh khi cho ăn trở lại.

Những biểu hiện của bệnh EMS trên cá thể tôm khi nhiễm bệnh EMS
-

Gan tôm bệnh thường gặp có nhiều trạng thái khác nhau như:
Sưng to, mềm nhũn.
Biến màu.
Nhiều trường hợp gan bị teo nhỏ và dai.
Vỏ mềm, đục cơ.

-

Giải phẫu mô học thường phát hiện:
Có đốm đen trên gan.
Tế bào gan bị hoại tử.

-

Lượng chất béo dự trữ trong gan hầu như không còn.

-

Mẫu gan tụy bị bội nhiễm ở các mức độ khác nhau.


-


-

Điều chỉnh các thông số kĩ thuật môi trường nuôi thích hợp.

-

Duy trì pH trong ao nằm khoảng 7.8-8.2.

-

Cho tôm ăn hợp lý, không nên để dư thừa, vì khi thức ăn dư thừa dễ gây ô
nhiễm môi trường và dễ phát sinh bệnh.


-

Trong quá trình nuôi hạn chế tôm bị shock, mất tảo,..

-

Cung cấp đầy đủ nhu cầu vitamin, acid amin và khoáng chất thiết yếu giúp
tôm sinh trưởng và tăng trong nhanh.

-

Thức ăn cho tôm nên thường xuyên trộn men tiêu hóa (men có lợi cho
đường ruột) nhằm mục đích hỗ trợ tiêu hóa thức ăn công nghiệp và đưa vào
đường ruột tôm một lượng lớn vi khuẩn có lợi, cạnh tranh lấn át vi khuẩn
có hại theo quy luật cạnh tranh sinh tồn để tôm ít bị bệnh.


nước, máy sục khí,…

-

Sau khi dùng kháng sinh trộn thêm men tiêu hóa để cung cấp vi khuẩn có
lợi cho đường ruột và chất giải độc gan giúp tôm mau hồi phục bệnh.

-

Diệt khuẩn và làm sạch nguồn ao nước nuôi để giảm mật độ vi khuẩn gây
bệnh có trong nguồn nước.


1.1.4 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.1.4.1 Sự bám vào tế bào
Bám vào tế bào là điều kiện đầu tiên để vi sinh vật có thể xâm nhập vào mô và
gây bệnh. Người ta đã quan sát thấy các vi khuẩn thường bám trên vật rắn hoặc các
hạt để tồn tại và phát triển. Bằng cách này chúng tránh được tác dụng của dòng
nước.
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thường đi theo dòng nước vào bên trong dạ
dày của tôm, và bám vào thành ruột.
Khả năng bám đặc hiệu này của vi khuẩn là một yếu tố quan trọng của độc lực.
Sự bám lên trên bề mặt của niêm mạc là bước đầu tiên của quá trình sinh bệnh, dẫn
tới việc tôm chết hàng loạt.
Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là adhesin. Bản chất của chúng là
polypeptide hoặc polysaccharide.
Các adhesion có bản chất polypeptide được chia thành 2 nhóm: nhóm có
fimbriae và nhóm không có fimbriae. Các fimbriae, hay còn gọi là các pili, là những
cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các
fimbriae được cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống

Xảy ra khi các vi sinh vật đi vào bên trong tế bào vật chủ và sống trong môi
trường nội bào. Một số tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn gram (-) có khả năng sống
bên trong tế bào. Các tế bào không có chức năng thực bào hay có chức năng thực
bào đều là đích tấn công của các tác nhân này.
1.1.4.3 Khả năng tạo vỏ
Một số vi khuẩn sản xuất ra một lượng lớn cá phân tử polysaccharide trọng
lượng phân tử cao, còn được gọi là exopolysaccharide. Lớp áo ngoại bào này gọi là
vỏ và được tạo ra nhằm mục đích kháng lại sự thực bào. Lớp vỏ giúp chúng chống
lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như đề kháng kháng sinh và có khả năng điều
hòa miễn dịch. Đó là lý do tại sao dùng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh EMS là
điều không khả thi.


1.1.4.4 Các enzyme
Nhiều vi khuẩn gây bệnh tạo được nhiều enzyme làm ảnh hưởng lớn tới tổ
chức mô của sinh vật chủ và quá trình ủ bệnh (Rasko và Sperandio, 2010).
Một số enzyme thường thấy do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus tạo ra là:
hemolysins, protease và chitinases.
Protease
Protease hay còn gọi là peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt
mối liên kết peptide (-CO-NH-) trong các phân tử polypeptide. Protease của vi
khuẩn có thể thủy phân một loạt các phân tử protein, tiêu diệt cấu trúc ngoại bào và
đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh. Qua các quá trình tiến hóa, protease đã
thích nghi với các điều kiện phức tạp trong sinh vật (thay đổi pH, môi trường khử
…) và sử dụng cơ chế xúc tác khác nhau cho chất nền thủy phân (Turk, 2006).
Dựa vào cơ chế hoạt động khác nhau mà chúng được phân loại như sau:
metalloproteases, protease serine, protease cystein, collagenases, caseinases và
gelatinases (Defoirdt, 2013). Nhiều tác giá đã báo cáo về sự hiện diện của protease
ở Vibrio spp. Theo Lee và cộng sự (1999), protease cysteine được xác định là một
yếu tố độc lực lớn của V. harveyi trong khi ở một nghiên cứu khác của Teo và cộng