BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA BỆNH CẰN MÍA
GỐC TRÊN MỘT SỐ GIỐNG MÍA TRIỂN VỌNG
VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN
BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THUẬN
Ngành: NÔNG HỌC
Niên khóa: 2003-2007

Tháng 10/2007


ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA BỆNH CẰN MÍA GỐC TRÊN
MỘT SỐ GIỐNG MÍA TRIỂN VỌNG VÀ NGHIÊN CỨU QUY
TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ THUẬN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ sư ngành Nông Học

Giáo viên hướng dẫn
PGS.TS. Bùi Cách Tuyến


cô trường Đại Học Nông Lâm đã nhiệt tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt
quãng đường sinh viên.
Cuối cùng, cảm ơn tất cả những người bạn thân, tập thể lớp Nông Học
29 cùng các anh chị em đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình
vươn lên trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Thủ Đức, ngày 15 tháng 10 năm 2007
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thuận

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Đánh giá mức độ ảnh hưởng của bệnh cằn mía gốc trên
một số giống mía triển vọng và nghiên cứu quy trình chẩn đoán bệnh bằng kỹ
thuật PCR” được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường, Bến
Cát, Bình Dương và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh, trường ĐH Nông Lâm
TP.HCM từ tháng 4 đến tháng 9/2007. Thí nghiệm khảo sát bệnh cằn mía gốc trên 5
giống mía triển vọng qua vụ mía tơ và mía gốc (K88-65, DLM24, VN84-4137, KU001-92, ROC26); 3 giống mía nuôi cấy mô và đối chứng (K88-200, K95-156, KU60-3),
mỗi giống chọn 3 điểm nằm trên một đường chéo góc, mỗi điểm chọn 3 cây để theo
dõi.
Đề tài nhằm tìm hiểu mức độ nhiễm bệnh cằn mía gốc trên một số giống mía
triển vọng qua hai vụ mía tơ và gốc, và ảnh hưởng của bệnh đến một số yếu tố sinh
trưởng của cây mía. Đề tài cũng nhằm nghiên cứu mức độ bệnh cằn mía gốc của một
số giống mía trồng từ nguồn nuôi cấy mô so với các đối chứng trồng bằng hom. Đồng
thời nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR.
Kết quả thu được:
-




MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Trang tựa

i

Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii
Tóm tắt ...................................................................................................................... iii
Mục lục ...................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vi
Danh sách các hình, biểu đồ ..................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................. viii
Chương 1. MỞ ĐẦU ........................................................ Error! Bookmark not defined.
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu của đề tài ............................................................................................... 2
1.4 Giới hạn đề tài ..................................................................................................... 3
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
2.1 Sơ lược về cây mía .............................................................................................. 4
2.1.1 Phân loại .................................................................................................... 4
2.1.2 Giá trị kinh tế của cây mía ......................................................................... 4
2.2 Sơ lược về bệnh .................................................................................................. 6
2.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc.................................................... 6
2.2.2 Lịch sử phát hiện và sự phân bố ................................................................ 7
2.2.3 Triệu chứng bệnh ....................................................................................... 9

trồng từ nguồn nuôi cấy mô........................................................................................... 41
4.4 Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Lxx ................................................................ 42
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 45
5.1 Kết luận ............................................................................................................. 45
5.2 Đề nghị .............................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 47
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 50

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp: base pair
ctv.: Cộng tác viên
CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide
CVB: colinized-vascular bundles
DNA: Deoxyribonucleoside acid
dNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate
EB-EIA: evaporative-binding enzyme immunoassay
EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
ITS: Internal Transcribed Spacer
Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli
MĐHH: Mật độ hữu hiệu
MĐTS: Mật độ tổng số
ns: non-significant
PCR: Polymerase Chain Reaction
PVP: Polyvinylpyrrolidone
RSD: Ratoon stunting disease
STM: Staining by Transpiration Method

Biểu đồ 4.7: Động thái phát triển chiều cao của các cây bị nhiễm bệnh ở các
mức độ khác nhau .........................................................................................................36
Biểu đồ 4.8: Tỷ lệ mạch thông trên một số giống mía nuôi cấy mô và đối chứng .....41
Hình 4.1: DNA tổng số ly trích từ mẫu lá mía ............................................................42
Hình PL1: Kết quả âm tính trong phản ứng PCR .......................................................50
Hình PL2: Cánh đồng mía tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường .......50
Hình PL3: Quá trình nhuộm cây mía trong thuốc nhuộm Safranin ............................51
Hình PL4: Mặt cắt ngang thân cây mía sau khi nhuộm Safranin ...............................51
Hình PL.5: Vết đổi màu bên trong cây mía bị bệnh ...................................................52
Hình PL.6: Cây mía bị bệnh có đốt thân ngắn hơn và đường kính nhỏ hơn so
với cây mía khỏe...........................................................................................................52
viivii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1: Các đặc điểm của bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli .....11
Bảng 3.1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR theo phương pháp của
Taylor và ctv. (2003) ....................................................................................................27
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR theo phương pháp của Taylor và ctv.
(2003) ........................................................................................................................... 27
Bảng 4.1: Mức độ nhiễm bệnh cằn mía gốc của một số giống mía triển vọng tại
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường .........................................................31
Bảng 4.2: Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên vụ tơ ở các mức độ nhiễm
bệnh khác nhau của một số giống mía triển vọng ....................................................... 32
Bảng 4.3: Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên vụ gốc ở các mức độ nhiễm
bệnh khác nhau của một số giống mía triển vọng ....................................................... 33

là quy hoạch vùng nguyên liệu, công tác giống mía, kỹ thuật canh tác và biện pháp bảo
vệ thực vật phù hợp,… đó chính là nền tảng phát huy được kết quả đầu tư tạo ra bước
tăng trưởng, ổn định về năng suất và chất lượng.
Tuy nhiên, qua thống kê nhiều năm cho thấy năng suất, sản lượng mía của nước
ta còn thua kém nhiều nước trong khu vực và trên thế giới (Thông tin Hiệp hội Mía
đường Việt Nam, 2006). Năng suất, sản lượng mía nguyên liệu thấp là do nhiều
nguyên nhân, trong đó phải kể đến tổn thất do sâu bệnh hại và bệnh cằn mía gốc
(ratoon stunting disease - RSD) do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli gây ra là một
trong những tác nhân quan trọng cần phải chú ý.
Ở nhiều nước trên thế giới, bệnh cằn mía gốc được đánh giá là một bệnh có ảnh
hưởng kinh tế quan trọng nhất làm giảm năng suất mía từ 5 – 60 %. Theo Croft và ctv.
(1995), bệnh RSD gây thiệt hại khoảng 10 - 20 triệu USD mỗi năm ở Úc. Ở Florida,
bệnh gây tổn thất 5 - 15 % sản lượng, vụ mùa 1988 - 1989 ước tính thiệt hại do bệnh
cằn mía gốc gây ra khoảng 36,8 triệu USD trên cơ sở ước tính thất thu khoảng 5 % sản
lượng mía (Comstock và Lentiti, 2005),…
1


Ở nước ta, chưa có nhiều tác giả đi sâu nghiên cứu bệnh cằn mía gốc. Việc
chẩn đoán bệnh dựa vào triệu chứng bên ngoài rất khó vì cây bị bệnh không biểu hiện
ra bên ngoài các triệu chứng đặc trưng rõ rệt. Mặt khác, tùy theo tính mẫn cảm mà mỗi
một giống mía bị nhiễm bệnh RSD ở những mức độ khác nhau. Vì vậy, việc nghiên
cứu mức độ ảnh hưởng của bệnh cằn mía gốc đến cây mía, tìm ra các giống mía chống
chịu bệnh đồng thời ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán nhanh và
chính xác bệnh là một yêu cầu cấp thiết nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống,
xây dựng các biện pháp phòng trừ và kiểm soát bệnh tốt hơn góp phần nâng cao năng
suất mía cho vùng nguyên liệu, phục vụ nhu cầu chế biến của nhà máy và cung cấp
cây mía giống đảm bảo chất lượng cho người trồng.
Xuất phát từ ý nghĩa trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Bùi Cách Tuyến và
sự hỗ trợ giúp đỡ của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía đường chúng tôi thực

2.1 Sơ lược về cây mía
2.1.1 Phân loại
Theo phân loại thực vật học cây mía thuộc:
-

Ngành có hạt (Spermatophyta).

-

Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae).

-

Họ hòa thảo (Gramineae).

-

Loại Saccharum L.
Trong loại Saccharum L. có 2 loài hoang dại (S. spontaneum L. và S. robustum

Brandes và Teswiet ex GrassL) và 4 loài trồng trọt (S. officinarum L., S. barberi
Jeswiet, S. sinense Roxb và S. edule Hassk). Các giống mía trồng hiện nay là sản phẩm
lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa các loài kể trên hoặc do tuyển chọn từ 3 loài: Saccharum
officinarum, Saccharum sinense và Saccharum barberi (Peter Sharpe, 1998).
2.1.2 Giá trị kinh tế của cây mía
Cây mía được trồng đầu tiên cho mục đích duy nhất là để làm thực phẩm ở
vùng Đông Nam Á và Thái Bình Dương. Việc sản xuất đường bằng cách đun sôi dịch
nước mía được khám phá đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm trước công nguyên.
Ngày nay, cây mía có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và là một trong những sản
phẩm gia đình rẻ nhất và được sử dụng rộng rãi nhất (Peter Sharpe, 1998).

tấn mía đem ép (Peter Sharpe, 1998).
Về mặt dinh dưỡng, theo phân tích của Peter Griffee (2000), trong 100 g cờ mía
có chứa 25 calo; 91 g nước; 4,6 g protein; 0,4 g chất béo; 3 g carbohydrate tổng số; 1 g
K; 40 mg Ca; 80 mg P; 2 mg Fe; 0,08 mg vitamin B1; 50 mg vitamin C. Trong 100 g lá
mía có chứa 75 calo; 77,5 g nước; 1,8 g protein; 0,8 g chất béo, 17,7 g carbohydrate
tổng số; 3 g chất xơ; 2 g K. Trong 100 g thân mía có chứa 62 calo; 82,5 g nước; 0,6 g
protein; 0,1g chất béo; 16,5g carbohydrate tổng số; 3,1 g chất xơ; 0,3 g K; 8 mg Ca, 6
mg P; 1,4 mg Fe; 0,02 mg vitamin B1; 0,01 mg vitamin B2; 0,1 mg vitamin B6; 3 mg
vitamin C (Trích dẫn theo Peter Sharpe, 1998).
5


Về mặt sinh học, theo tác giả Trần Thùy (1996), so sánh với một số cây công
nghiệp, cây mía có nhiều ưu điểm. Nhờ đặc điểm có chỉ số diện tích lá lớn và khả năng
lợi dụng ánh sáng mặt trời cao trong thời gian 10 - 12 tháng, 1 ha mía có thể cho năng
suất hàng trăm tấn mía cây và một khối lượng lớn lá xanh, gốc rễ để lại trong đất. Mía
có khả năng để gốc được nhiều năm tức một lần trồng mà thu hoạch được nhiều vụ và
giảm được chi phí sản xuất. Cây mía có khả năng thích ứng rộng có thể trồng ở nhiều
vùng sinh thái khác nhau, chống chịu tốt với các điều kiện khắc nghiệt của tự nhiên và
môi trường.
2.2 Sơ lược về bệnh
2.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc
a) Trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều tác giả đi sâu nghiên cứu bệnh cằn mía gốc trong
những năm qua.
-

Năm 1945, Steindl đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại
Australia.



Năm 1997, Bailey và Bechet nghiên cứu ảnh hưởng của RSD đến năng suất mía
dưới các điều kiện có tưới và điều kiện nhờ nước trời.

-

Năm 1998, Pan và ctv. đã đưa ra protocol để chẩn đoán Lxx trong dịch khuẩn lạc
nuôi cấy và trong dịch chiết nước mía dựa vào cặp mồi Cxx. Cũng trong năm này,
6


Fegan và ctv. đã xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phát hiện tác
nhân gây bệnh RSD bằng phương pháp thử nghiệm PCR.
-

Năm 1999, Hoy và ctv. nghiên cứu về sự lan truyền và gia tăng RSD và so sánh
các phương pháp phát hiện bệnh.

-

Năm 2002, Croft dùng phương pháp enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
để phân loại các giống mía về tính kháng RSD.

-

Năm 2003, Taylor và ctv. đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch chiết
nước mía có tính đặc hiệu hơn và được chứng minh là có độ nhạy cao.

-




triệu chứng cằn cỗi bất thường, trong khi ở vụ mía tơ không biểu hiện triệu chứng này
một cách rõ ràng. Đầu tiên, người ta chưa biết được tác nhân gây ra hiện tượng phát
triển bất thường này cũng như cách phân bố và chẩn doán bệnh. Steindl (1949) cho
rằng sự di chuyển của tác nhân gây cằn cỗi nhờ vào sự di chuyển của dịch cây và từ đó
lây bệnh khắp cây, còn đối với quá trình lây bệnh giữa cây với cây thì có thể là do quá
trình thu hoạch người ta dùng máy hoặc dao chặt những thân cây bị bệnh sau đó chặt
sang thân cây khỏe thì dịch cây bị bệnh sẽ nhiễm vào cây khỏe (Trích dẫn theo
Gillaspie và Teakle, 1989).
Năm 1950, Steindl đã phát hiện một triệu chứng nữa trên thân cây mía bị bệnh
của giống Q28 đó là những vết đổi màu vàng cam của các bó mạch bên trong đốt mía
khi xem xét trên vết chẻ dọc thân cây. Sử dụng triệu chứng này để chẩn đoán bệnh,
Steindl và Hughes (1953) đã chỉ ra rằng bệnh cằn mía gốc đã phân bố khắp các cánh
đồng trồng mía ở Queensland, xâm nhiễm hầu hết các giống mía và gây ra tổn thất
đáng kể. Năm 1956, Steindl và Hughes đã báo cáo thêm về một cách nhận biết bệnh
đó là những vết màu hồng bên trong thân của các chồi non mới mọc (Trích dẫn theo
Gillaspie và Teakle, 1989).
Đã nhiều năm bệnh RSD được cho là do virus gây ra bởi vì việc nuôi cấy vô
trùng vi khuẩn đã không thành công và từ sau khi phát hiện ra bệnh ở Úc, người ta đã
kiểm tra và phát hiện rằng hầu hết các vùng trồng mía trên khắp thế giới đều bị nhiễm
RSD. Tuy nhiên, triệu chứng là phương tiện duy nhất để chẩn đoán bệnh cho tới năm
1973, Gillaspie và ctv. đã phát hiện thấy một loại vi khuẩn đang liên kết với những cây
mía bị nhiễm bệnh (Trích dẫn theo Gillaspie và Teakle, 1989). Vào những năm 1980,
vi khuẩn đã được nuôi cấy thành công và quy tắc Koch chứng thực nó là tác nhân gây
bệnh cằn mía gốc (Davis và ctv., 1980; 1984). Vi khuẩn này đầu tiên được đặt tên là
Clavibacter xyli subsp. xyli (Davis và ctv., 1984) dựa trên các đặc điểm về hình thái
học nhưng gần đây nó được xem xét lại và đặt tên là Leifsonia xyli subsp. xyli
(Evtushenko, 2000) dựa trên sự phân tích gen rRNA của vi khuẩn. Sự phân loại này
được xác nhận gần đây bởi Young và ctv. (2006) (Trích dẫn theo Brumley và ctv.,

đường kính thân nhỏ hơn so với cây
khỏe và đôi khi số cây/bụi ít hơn bình
thường khi bệnh nghiêm trọng. Ở các
vụ gốc, triệu chứng còi cọc của cây
bệnh biểu hiện rõ ràng hơn so với vụ
tơ và ở một số giống mẫn cảm cao có
thể thấy cây bị rũ xuống trong điều

Hình 2.2: Thân cây bị bệnh có đường kính

kiện thiếu độ ẩm và các vết chết hoại

nhỏ hơn và đốt thân ngắn hơn cây khỏe.
(E.A. Giglioti, 1999)

trên đỉnh và mép lá phát triển (Davis
và Bailey, 2000).

Sự cằn cỗi biểu hiện không đồng nhất giữa các cây bị nhiễm bệnh và cánh đồng
bị nhiễm thường xuất hiện một sự phát triển “lên và xuống” (“up and down”) do khác
9


nhau về mức độ còi cọc của các cây kế cận nhau bên trong cánh đồng (Gillaspie và
Teakle, 1989).
b) Triệu chứng bên trong
Steindl (1961) đã mô tả
chi tiết về hai triệu chứng quan
sát được bên trong cây mía bị
nhiễm bệnh RSD: ở những đốt



2.2.4 Tác nhân gây bệnh
Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) là một vi
khuẩn Gram dương, thuộc loại coryneform,
không di động, không hình thành bào tử, háo
khí và sống ký sinh bắt buộc. Vi khuẩn có kích
thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 – 4 µm) và sinh sản
theo cách nhân đôi. Các tế bào vi khuẩn có
hình gậy mảnh, dạng thẳng hoặc hơi cong
nhưng một vài tế bào lại căng phình ra ở ngoại
biên hay ở giữa tế bào. Các khuẩn lạc trên môi

Hình 2.4: Vi khuẩn Lxx dưới kính
hiển vi điện tử (x 30.000 lần)

trường SC không màu và có hình tròn với

(S.M.Brumbley, 2006)

đường kính 0,1 - 0,3 mm. Mesosome của vi
khuẩn có dạng phiến, thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn và thành tế bào
trơn ở bên ngoài. Nó không có lớp vỏ polysaccarit nhớt như ở một vài loài vi khuẩn
coryneform gây bệnh cây khác. Peptidoglycan của tác nhân gây bệnh có chứa 2,4diaminobutyric acid (DAB) (Davis và ctv., 1980; 1984).
Monteiro-Vitorello và ctv. (2004) đã xác định được nhiễm sắc thể vòng đơn của
vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli CTCB07 có chiều dài 2,6 Mb, các đặc điểm và
thành phần như trong bảng 2.1, trong đó thiếu các gen trao đổi chất và sinh tổng hợp
acid amin (đặc biệt là các gen sinh tổng hợp cystein và methionin nên chúng trở nên
rất khó nuôi cấy.
Bảng 2.1: Các đặc điểm của bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli

cách có ý nghĩa đến 100 hom tiếp sau mà được chặt bởi cùng con dao đó (Trích dẫn
theo Frison và Putter, 2005).
Tác nhân gây RSD có thể lan truyền trong suốt quá trình nhân giống bởi các
hom bị nhiễm bệnh từ cánh đồng này sang cánh đồng khác. Bởi vì triệu chứng của
bệnh không dễ dàng thấy được nên các vi khuẩn đã được lan truyền một cách không

12


ngờ từ vùng này sang vùng khác hay từ quốc gia này sang quốc gia khác qua con
đường trao đổi giống (Gillaspie và Teakle, 1989).
Một số động vật nhai cây mía (như chuột) cũng có khả năng lan truyền vi khuẩn
khi chúng gặm trên một cây mía bị bệnh và sau đó gặm trên một cây mía khỏe mạnh
(Comstock và Lentini, 2005).
Tác nhân đã được tìm thấy duy nhất ở cây mía trong tự nhiên và không có các
vectơ truyền lan. Sự lan truyền từ cây này sang cây khác hay từ bộ phận này đến bộ
phận khác bên trong một cây được thực hiện một cách thụ động thông qua các vết
thương nơi mà vi khuẩn có thể được di chuyển và xâm chiếm các cơ quan khác của
cây như rễ, lá và thân. Vi khuẩn không lan truyền qua hạt. Tác nhân có thể sống và tồn
tại vài tháng trên tàn dư thực vật hoặc trong đất, nó góp phần gây hại nặng trên mía
gốc ở những vùng có bệnh. Mía tái sinh từ gốc sót lại dễ dàng lây sang mía tơ ở mùa
trồng mới (Davis và Bailey, 2000).
Tốc độ lan truyền bệnh và phạm vi lây nhiễm có liên quan trực tiếp đến tính
mẫn cảm của giống. Sự giảm năng suất thỉnh thoảng lớn hơn ở các vụ gốc tiếp theo có
thể là do sự gia tăng tỷ lệ bệnh. “Stress” về ẩm độ, là kết quả của sự hạn hán hoặc ngập
úng có thể làm gia tăng sự giảm năng suất do bệnh. Sự kết hợp giữa bệnh khảm và
bệnh cằn mía gốc có thể xảy ra cùng một lúc làm cho cây bệnh bị thiệt hại về năng
suất rất lớn so với chỉ nhiễm một bệnh (Davis và Bailey, 2000).
2.2.6 Phổ ký chủ
Cây mía là ký chủ tự nhiên duy nhất của tác nhân gây bệnh. Nhiều loài cỏ được

rất cao như ở Swaziland 30 %; Zambia 50 %, Kenya, Malawi, Uganda và Zimbabwe
60 – 90 %; đặc biệt ở các vùng Tanzania và Mazambisse (thuộc Mozambique) nhiễm
đến 100 %. Các thí nghiệm đồng ruộng đã cho thấy RSD có thể làm giảm năng suất 15
– 30 % dưới các điều kiện tưới tiêu tốt và 20 – 40 % dưới điều kiện trồng nhờ nước
trời ở các giống trồng phổ biến ở Châu Phi.
2.2.8 Các phương pháp chẩn đoán bệnh
Phương pháp chẩn đoán truyền thống là dựa vào ba triệu chứng của quá trình
xâm nhiễm bao gồm:
(1) Triệu chứng bên trong cây mía non.
(2) Triệu chứng bên trong cây mía trưởng thành.
(3) Triệu chứng cằn cỗi của các cây chỉ thị: Chủng dịch chiết của cây mía cần kiểm tra
vào các giống mía mẫn cảm hoặc các loài cỏ có quan hệ thân thuộc như cỏ gấu, cỏ
14


gà,… Sau 2 - 5 tuần lây bệnh sẽ thấy được triệu chứng trên các cây này nếu như
dịch chiết ban đầu có bệnh.
Tuy nhiên, việc chẩn đoán RSD dựa vào triệu chứng là rất khó khăn bởi vì
cường độ biểu hiện triệu chứng khác biệt lớn giữa các giống cũng như giữa các cây
trong cùng một giống. Ngoài ra, các triệu chứng bên trong và bên ngoài cây bệnh dễ bị
lầm tưởng với các nguyên nhân khác như nguồn bệnh khác, côn trùng, các nhân tố môi
trường và sự thiệt hại cơ giới (Gillaspie và Teakle, 1989).
Các kỹ thuật kính hiển vi ánh sáng như kính hiển vi có pha tương phản (phase
constrast), kính hiển vi có quang trường tối (dard-field microscopy), và kính hiển vi
điện tử (electron microscopy) cũng được sử dụng như một công cụ để phát hiện tác
nhân gây bệnh. Trong đó, phương pháp kiểm tra dịch chiết bằng cách sử dụng kính
hiển vi có pha tương phản được sử dụng nhiều nhất để chẩn đoán RSD. Teakle và ctv.
(1973) đã mô tả về hình dạng của vi khuẩn gây bệnh RSD trong dịch chiết của cây mía
bị bệnh dưới kính hiển vi. Một vài ml của dịch chiết vô trùng được hút ra từ thân cây
mía bị nhiễm bệnh trong môi trường chân không và dịch chiết được ly tâm để tập trung

Phương pháp Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) được Harris và Gillaspie
phát triển năm 1979 và có thể phát hiện vi khuẩn Lxx ở nồng độ 1 x 105 tế bào/ml.
Davis và Dean (1984) đã phát triển phương pháp kháng thể gắn huỳnh quang trực tiếp
(direct fluorescent-antibody) nhờ đó mà vi khuẩn được tập trung tại thành màng lọc,
phương pháp này nhạy hơn có thể phát hiện vi khuẩn Lxx ở nồng độ 1 x 104 tế bào/ml,
nhưng kỹ thuật này chủ yếu sử dụng như một công cụ nghiên cứu bởi vì nó chậm và
đòi hỏi có kính hiển vi quang học (Trích dẫn theo Gillaspie và Teakle, 1989).
Vi khuẩn cũng có thể được phát hiện dựa vào các phản ứng hóa miễn dịch khác
nhau. Hai phương pháp có thể phân tích được nhiều mẫu cùng một lúc là tissue blot
enzyme immunoassay (TB-EIA) và evaporative-binding enzyme immunoassay (EBEIA). TB-EIA giúp phát hiện và đếm các bó mạch dẫn bị xâm nhiễm trên các mặt cắt
ngang thân. EB-EIA là một biến thể của phương pháp ELISA để phân tích dịch chiết
trong bó mạch dẫn khi nước bốc hơi, trong phương pháp này các kháng thể đặc hiệu
được kết hợp với các thành phần khác để tạo ra phản ứng màu khi vi khuẩn hiện diện.
Phòng thí nghiệm BSES kiểm tra khoảng 50.000 mẫu mỗi năm sử dụng phương pháp
EB-EIA trong ngành công nghiệp mía đường nước Úc (Frison và Putter, 2005). Cải
tiến hai phương pháp trên, Giglioti (1999) đã đề nghị phương pháp Staining by
Transpiration Method (STM) để xác định số lượng mạch dẫn bị nhiễm vi khuẩn. STM
nhuộm các bó mạch dẫn hoạt động (mạch dẫn thông) và không nhuộm các bó mạch
dẫn không hoạt động (mạch dẫn tắc).
16