ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá


Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quý báu đó !
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Học viên

Lý Thị Huyền


3

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... iii DANH
MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH
MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi DANH
MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.
Lý
do
chọn
đề
.....................................................................................................1

tài

2.
Mục
tiêu

1.1.3.
Cơ
chế
xúc
...................................................................................................8
1.1.4.
Nguồn
thu
...........................................................................................9

tác
protease

1.1.5.
dụng.........................................................................................................11
1.2.
Sinh
tổng
hợp
.......................................................................................14
1.2.1.
Chủng
....................................................................................................14

Ứng
protease
giống

1.2.2.
Môi

protease
............................................................19

từ

Aspergillus

1.3.1.
Aspergillus
...........................................................................................19
1.3.2.
Sản
xuất
chế
............................................................................20

phẩm

oryzae
oryzae
protease

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............24
2.1.
Nguyên
liệu
.....................................................................................24

nghiên


3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy .................................................................................36
3.2.5. Tối ưu pH nuôi cấy .........................................................................................37
3.2.6. Tối ưu thời gian lên men .................................................................................39
3.3. Sản xuất chế phẩm .............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44
PHỤ LỤC .................................................................................................................48


6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
..............................................4
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...........................................24
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................................25
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm ...........25
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine ....................................................................27
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô...................................29
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo .............30


7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease ............................................................................5
Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain)
...............................................6


Bột đậu tương

LN

Lõi ngô

CG

Cám gạo

TCA

Tricloacetic acid

OD

Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng)

Hdp

Hoạt độ protease

hspl

Hệ số pha loãng

HT

Hoạt tính

dược phẩm Hoa Kỳ. A. oryzae có một lịch sử sử dụng lâu dài trong ngành
công nghiệp thực phẩm trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, do
hoạt tính phân giải protein cao [16, 24]. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, protease, pectinase, lipase,
xylanase, cellulase, catalase, phytase, glucose oxidase [23].
Sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện
đáng kể hiệu quả sản xuất, chế phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá
thành chế phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng
nhiều. Để phát triển các dây truyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có
nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm
kiếm cơ chất mới


2

thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều
kiện môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng
được các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tm ra điều kiện nuôi cấy
phù hợp nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm.
Để có thể chủ động sản xuất enzyme protease bằng các nguồn nguyên liệu
sẵn có trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu một số
điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của
chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC – F - 0187”
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC F - 0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh protease của chủng A. oryzae VTCC - F – 0187
sau thời gian bảo quản chủng giống.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường và điều
kiện lên men đến khả sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F - 0187.


1.1.2. Phân loại protease
Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử,
protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không
dễ dàng tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa
dạng về cấu trúc và khả năng hoạt động.
1.1.2.1. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu
Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH
hoạt động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và
protease kiềm [1].
Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
Protease
Protease acid

Đặc điểm
Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic
protease, một số cysteine protease và metalloprotease

Protease

trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease,

tính

metalloprotease và một số serine protease

Protease kiềm

Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease

subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtlisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như Subtlisin Carlsberg, Subtlisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng.

Hình 1.3. Mô hình phân tử protease (papain) [11]
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong
trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.


Hình 1.4. Mô hình phân tử protease (renin) [17]
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và
protease- tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các
dẫn suất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid
thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của
amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu
tương đối kỹ về câu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này

enzyme
- sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme
tự do và sản phẩm [8].
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc
tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng
đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme
và cơ chất thành hợp chất trung gian [2].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)


1.1.4. Nguồn thu protease
1.1.4.1. Protease động vật
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa
nhiều enzyme nhất.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến
trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có
khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình
đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất.
Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu
chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả
năng tiết ra pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên
cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài
Eudothia parasitca và Mucor purillus [1].
1.1.4.2. Protease thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu
được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ
quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để
chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết
tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công

chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại
protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các
protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [1].
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...


cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong
sản xuất pho mát.
* Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên
cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một
số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.
fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease
được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả
năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino
acid. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân
karetin. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao nên còn được
dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
Như vậy, vi sinh vật được coi là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để
sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng
nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: Chủ động về nguyên liệu
nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật; Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật
ngắn: 16-100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm; Có thể điều
khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng
và tăng hiệu suất tổng thu hồi); Giá thành tương đối thấp vì môi trường
tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản xuất. Tuy nhiên trong mọi trường hợp
cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng
ngừa, xử lý thích hợp [1].
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi
sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng

enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian
làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại
cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ [25].
1.1.5.3. Trong công nghiệp sữa
Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông
tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất phomat. Trong công


nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng
độ dẻo và làm


nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn [25].
1.1.5.4. Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền
của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy
phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự
thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính
làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da
có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi
thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân
lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách
từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtlis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và
xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã
đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [25].
1.1.5.5. Trong công nghiệp dệt
Protease từ vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân
tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi